[发明专利]一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法

摘要

本发明提供一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，属于农业科学技术领域。水稻黑条矮缩病毒主要通过介体昆虫灰飞虱进行传播。采用常规RT-PCR方法检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒需提取单头灰飞虱RNA，之后再进行反转录和PCR检测。单头灰飞虱RNA提取存在成本高和耗时长等缺点。本发明用无菌水清洗灰飞虱虫体后，加入DEPC水，采用牙签捣碎虫体的方法使灰飞虱体内的RNA包括水稻黑条矮缩病毒RNA释放出来，通过离心获得上清液，之后用此上清液进行反转录和PCR。此方法无需提纯单头灰飞虱RNA，可以快速检测单头灰飞虱体内的水稻黑条矮缩病毒，大大降低了检测成本，缩短了检测时间。

主权项

一种快速检测单头灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒的方法，包括以下步骤：(1)灰飞虱在‑20℃冷冻5min，取出单头灰飞虱装入0.2mL离心管，加入100μL的无菌水清洗灰飞虱，清洗2次后加入30μL DEPC水，用无菌牙签捣碎虫体，10000g离心1min，取上清。(2)以离心后获得的上清液为模板，用随机引物进行反转录。反转录方法为：在0.2mL离心管内加入9.5μL上清液和1μL随机引物Random6。70℃放置5min后立即取出置于冰上放置1min，依次加入5×M‑MuLV反转录酶缓冲液3μL、dNTPs(10mM/dNTP)0.5μL、RNase inhibitor(20U/μL)0.5μL、M‑MuLV反转录酶(200U/μL)0.5μL，42℃放置1h，70℃保温5min。(3)以反转录产物为模板，采用RBSDV病毒的特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，若PCR能扩增到与预期大小一致的电泳条带则表明单头灰飞虱中含有RBSDV。RBSDV病毒的特异性引物可根据NCBI中已登录的RBSDV的基因组S1～S10序列进行设计。PCR方法为：在0.2mL的离心管中分别加入反转录产物5.0μL，10×PCR缓冲液2.5μL，10mM/dNTP0.5μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.5μL，最后用ddH2O补足至25μL。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1min，35～40个循环；72℃延长10min。