[发明专利]一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法

摘要

本发明公开了一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，步骤如下：一、鱼肉DNA的提取，二、PCR扩增，三、酶切及电泳检测，四、鉴定；通过上述四个步骤即可准确的测定大西洋鲑鱼。本发明具有操作简单，快速准确、价格低廉和对仪器设备要求低等特点。

主权项

一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，其特征在于，步骤如下： 一、鱼肉DNA提取：称取鱼肉于灭菌离心管中，加入TE抽提液，用消毒后的小剪刀将鱼肉组织剪碎，然后，加入10％SDS至终浓度为1.9～2.1％，20mg/ml蛋白酶K至终浓度为400μg/L，充分混匀，将离心管置于55～65℃的恒温水浴槽中，直至混合液消化至澄清为止；取出消化好的样品，加入6M饱和的NaCl溶液300μg，高速涡旋30s，12000r/min离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其混合比例为25∶24∶1，缓慢震荡1min，12000r/min离心10min；取上清液至新的离心管中，重复上一步骤1～2次，然后取上清液至新的离心管中，加入1/10体积3M NaAc，2倍体积‑20℃预冷的无水乙醇，12000r/min离心10min，弃去上清液，在50℃烘箱中烘干，然后加入100μgTE或dH2O，于‑20℃保存； 二、PCR扩增：DNA模板100～500ng，含Mg2+10×缓冲液5μL，2.5mol/L dNTPs4μL，25μmol/L SWF1和25μmol/L SWR1各0.6μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.3μL，加去离子水至50μL；PCR扩增反应程序为：94℃2min；94℃30s，46℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min； 三、酶切及电泳检测：酶切采用20μL的体系，取PCR产物10μL，10×缓冲液2μL，限制性内切酶HindIII或Msc I1～2μL，加去离子水补齐至20μL，然后置于金属浴37℃酶切3～5h，酶切反应完以后，取5μL PCR产物与1μL预染液混合，预染2～3min，于1.5～2％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照分析电泳结果； 四、鉴定：限制性内切酶Msc I和HindIII对5种三文鱼COI扩增片段的酶切分析，即可对大西洋鲑鱼及其制品的进行鉴别。