[发明专利]一种表达猪小肠三叶因子的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及用途

摘要

本发明公开了一种表达猪小肠三叶因子基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及用途，根据已公开的猪小肠三叶因子的基因序列及表达载体质粒特点，设计含特异酶切位点的引物；以猪小肠黏膜为材料，通过RT-PCR获得含有猪小肠三叶因子基因的片段，将其与乳酸菌表达载体质粒pMG36e进行连接，获得重组质粒pMG36e-itf3，通过电转化方法将该重组质粒转入嗜酸乳杆菌内，得到表达猪小肠三叶因子的重组嗜酸乳杆菌，在乳链菌肽(nisin)的诱导下进行表达，并经SDS-PAGE和Western blot分析证明目的基因得到正确表达。该重组菌用于防治腹泻的发生，改善猪的肠道健康，提高生长性能。

主权项

一种表达猪小肠三叶因子基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）猪小肠三叶因子基因的获得：提取猪小肠黏膜RNA，经过反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，设计合成含有Xma I和Sph I酶切位点的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分别具有猪itf3基因（Gene ID： AM283538.1）的序列，采用PCR方法扩增猪itf3基因片段。将所扩增的itf3目的基因片段与克隆载体pMD18T载体连接，得到重组质粒，转入大肠杆菌DH5a中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，并通过酶切鉴定和测序分析验证，验证正确的质粒命名为pMD18T‑itf3，重组质粒序列测定表明该质粒具有猪itf3的基因序列。（2）重组表达载体pMG36e‑itf3的构建：将乳酸菌表达载体pMG36e和克隆质粒pMD18T‑itf3用限制性内切酶Xma I和Sph I进行双酶切，纯化回收双酶切的线性化的pMG36e载体片段和itf3目的基因片段，并将线性化的载体片段和目的基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，通过红霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定正确后，命名为pMG36e‑itf3，其具有猪itf3的基因序列。（3）表达猪小肠三叶因子的重组嗜酸乳杆菌的构建：采用电转化方法将重组质粒pMG36e‑itf3转化入嗜酸乳杆菌NZ6092感受态细胞中，利用红霉素抗性进行筛选，得到重组菌，命名为：NZ6092‑itf3。（4）猪小肠三叶因子在嗜酸乳杆菌中的诱导表达及SDS、Western Blot分析：挑取重组菌NZ6092‑itf3接种于含有100ug/mL红霉素的MRS液体培养基中，诱导表达。得到大小为8Kda左右的蛋白条带。