[发明专利]一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法

摘要

本发明提供一种检测大麦种子纯度的方法，将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提，再通过一系列步骤提纯，得到大麦的水溶蛋白，将人工混种不同纯度大麦的蛋白进行双向电泳，分析双向电泳图可以找到混种的差异性蛋白点。应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图，利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线，可以准确检测大麦种子的纯度。

主权项

一种利用双向电泳检测大麦种子纯度的方法，具体操作步骤如下：第一步、蛋白提取：取人工混种不同纯度的大麦经手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h，并漩涡震荡3~5次，10000g离心10min，取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚，室温提取30min，10000g离心10min，酚相加入4倍体积清洗液A，‑80℃提取3h，10000g离心10min；离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后，冷冻干燥；将得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液，室温漩涡振荡裂解1h，4℃裂解过夜，13000ppm4℃离心10min，取5μL上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量，按上样量分装，准备电泳；第二步、双向电泳：取蛋白上清液加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条，上样量为110μg；电泳条件：倒入电泳缓冲液，接通电源，室温下200V恒压电泳30min，500V恒压电泳30min，1350V恒压电泳4h，进行等电聚焦；等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min，转移至12%的分离胶上，20mA恒流垂直电泳；第三步、染色及分析：电泳结束后将凝胶置于固定液中固定1~2h，考马斯亮蓝法进行染色，利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件找到该纯品种与混种的差异性蛋白点，进行3D效果图的比较，绘制差异性蛋白点3D图高度与纯度关系的标准曲线；第四步、对待测样品进行电泳，得到同一区域蛋白点的3D图，并计算其纯度；以上所述配方中，提取液所用试剂均为优级纯，其余试剂均为分析纯，所用水为双蒸水或超纯水，其中：提取液：0.1M/L Tris‑HCl pH8.8，50mM/L二巯基苏糖醇，20mM/L乙二胺四乙酸，1mM/L苯甲基磺酰氟，1μM/L胃蛋白酶抑制剂和10mM/L亮肽素，余量为水；清洗液A：100mM/L醋酸铵、10mM/L二巯基苏糖醇的甲醇溶液；清洗液B：10mM/L二巯基苏糖醇的90%乙醇；裂解液：7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，1%(w/v)二巯基苏糖醇，0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10，2%(v/v)载体两性电解质pH4~6，10mM/L苯甲基磺酰氟，余量为水；样品缓冲液：7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，1%(w/v)二巯基苏糖醇，0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10，2%(v/v)载体两性电解质pH4~6，10mM/L苯甲基磺酰氟，10mg/L溴酚蓝，余量为水；自制胶条配方：0.6g尿素、540μL水、30%丙烯酰胺溶液200μL、pH4~6载体两性电解质24μL、pH3~10载体两性电解质溶液4.8μL，轻缓混匀后加入5μL10%过硫酸胺和4μL四甲基乙二胺，轻轻混匀；快速吸取上述混合液，从直径1mm、长11cm玻璃管的一端缓慢均匀灌入约7cm，室温聚合1h；电泳缓冲液中，阴极电泳缓冲液：20mM/L氢氧化钠溶液150mL，阳极电泳缓冲液：10mM/L磷酸溶液200mL；平衡缓冲液：0.05M/L三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液pH8.8、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V)十二烷基硫酸钠、6mM/L尿素，余量为水；分离胶：3.3mL双蒸水、4.0mL30%丙烯酰胺、2.5mL1.5M/L Tris‑HCl、0.1mL10%SDS、0.1mL10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺，余量为水；固定液：10%乙酸，40%乙醇，余量为水；染色液：0.12%考马斯亮蓝G‑250,10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇，余量为水。