[发明专利]一种合成的重组鸭β-防御素-2蛋白的重组酵母阳性转化子的生产方法

摘要

一种合成的重组鸭β-防御素-2蛋白的重组酵母阳性转化子的生产方法，其特征在于：（1）重组质粒的制备和线性化；（2）毕赤酵母电转化感受态细胞的制备；（3）毕赤酵母的电击转化：重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建。本发明与已有技术相比，具有抗菌促生长活性，适合于在畜牧生产中进行应用，而且生产成本低、生产效率高的优点。

主权项

一种合成的重组鸭β‑防御素‑2蛋白的重组酵母阳性转化子的生产方法，其特征在于，（1）重组质粒的制备和线性化：挑取转化入重组质粒pPICZα‑A‑AvBD2的Top 10阳性菌接种于25 mL含25μg/mL Zeocin的低盐液体LB培养基中，37℃，220 rpm振摇培养24 h，将菌液于4℃，5 000rpm离心10 min，沉淀细菌，然后用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒，用Sac I酶将抽提的重组质粒pPICZα‑A‑AvBD2线性化，（2）毕赤酵母电转化感受态细胞的制备：接种毕赤酵母宿主菌X33单菌落至5mL YPD培养基中，30℃过夜培养，YPD含1wt%酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、2 wt %葡萄糖，然后接种0.1～0.5mL过夜培养菌液到500mL新鲜YPD培养液，30℃培养，使OD600nm达到1.2～1.3，4℃ 3 000r/m离心5min，弃上清；依次以500mL、250mL冰浴灭菌水及20mL冰冷1mol/L山梨糖醇重悬菌体洗涤，4℃ 3 000r/m离心5min，离心3次；最后将细胞重悬于1mL冰浴灭菌的1mol/L山梨糖醇，即为毕赤酵母感受态细胞，（3）毕赤酵母的电击转化：取80μL准备好的毕赤酵母感受态细胞，与5～10μg线性化的重组质粒pPICZα‑A‑AvBD2混合，转移到冰浴的0.2cm电转杯中，冰浴15min，于2000‑Y型基因导入仪进行电击转化，电脉冲参数为电压1500V，电容量25μF，电阻200Ω，电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨糖醇到电转化小杯中，将小杯内悬液转移到一个灭菌的15mL的试管中，将试管在30℃下孵育1～2小时，取10、25、50、100与200uL分别铺到含有200μg/mL Zeocin YPDS平板上以筛选高拷贝转化子，30℃孵化平板2~3d至出现乳白色的酵母转化菌落即为含鸭β‑防御素‑2的酵母重组转化子，Zeocin YPDS包含1 wt %酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、2 wt %葡萄糖、1M山梨糖醇、20g琼脂粉。