[发明专利]一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法及其应用，属于分子生物学DNA标记技术与应用领域。该微卫星分子标记的构建方法包括长薄鳅微卫星四碱基重复单元富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，根据长薄鳅四碱基重复核心序列，在其两端设计特异性引物，经PCR扩增检测，最终筛选得到了13对多态性高的微卫星分子标记。本发明主要应用于长薄鳅资源监测、遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子辅助育种等方面。

主权项

一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）长薄鳅基因组DNA微卫星序列的获得:利用生物素四碱基重复探针和长薄鳅基因组酶切片段杂交，然后采用磁珠富集法获取长薄鳅基因组中的四碱基重复单元微卫星片段，经过克隆、阳性鉴定后进行测序，最终筛选出的13对多态性高的微卫星位点，用SSRHunter软件查找四碱基重复次数大于5的微卫星DNA序列；（2）微卫星引物的设计：在四碱基重复单元微卫星侧翼，用软件PRIMER3.0设计引物，引物长度为18‑25bp，GC含量30‑70%，退火温度大于50℃，扩增片段的长度为100‑350bp；（3）微卫星标记标记引物的检测：对设计的微卫星标记引物进行PCR扩增，反应在MJ‑100PCR仪上进行，扩增程序为：94℃预变性2分钟，35个循环，最后72℃延伸10分钟。反应体系为：正反引物各0.2μM，0.2mM dNTP，1×PCR Buffer，1.5‑2.5mMMg2+，Taq酶0.5U,10‑50ngDNA模板，用蒸馏水补足到总体积到10μl。模板为随机挑选的6个长薄鳅样本。用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，银染观察微卫星条带多态性情况，最后得到13对条带清晰、多态性高的长薄鳅微卫星分子标记。