[发明专利]一种人活性颗粒酶K重组蛋白的制备方法

摘要

本发明涉及一种人活性颗粒酶K重组蛋白（rhGzmK）的制备方法，该重组蛋白去除了人颗粒酶K（hGzmK）N端的24个氨基酸，并在C端增加了6个组氨酸，以方便用镍离子柱进行纯化。其流程是：抽提人NK92细胞的总RNA，利用RT-PCR技术得到hGzmK基因，将之与原核表达载体pET24a(+)相连，构建重组表达质粒pET24a(+)-hGzmK，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌，该工程菌经IPTG诱导可表达rhGzmK。该重组蛋白以包涵体的形式表达，可利用镍亲和层析柱进行纯化，其纯度可达95%以上。该方法具有操作简单、产量高、重组蛋白易于纯化等特点，且纯化蛋白具有较高的生物学活性。

主权项

一种人活性颗粒酶K重组蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：a）获得hGzmK的cDNA提取人NK92细胞中的总RNA，用RT‑PCR的方法获得cDNA，然后用特异PCR扩增获得hGzmK基因；b）构建和鉴定重组表达载体pET24a(+)‑hGzmK将得到的hGzmK PCR产物与原核表达载体pET24a(+)分别进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物回收后于16 ℃过夜连接，连接产物转化大肠菌DH5α后提取质粒并用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到约720 bp条带，证明pET24a(+)‑hGzmK重组质粒构建成功；c）重组质粒pET24a(+)‑hGzmK转化大肠杆菌BL21转化是指：将所述重组质粒pET24a(+)‑hGzmK加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，然后置于冰上冷却后进行热击；加入无抗生素培养基后培养60min，涂布于kan+ LB平板，经37℃培养12‑16h，得到hGzmK阳性转化子细菌；d）hGzmK重组蛋白的表达和鉴定将所述阳性转化子细菌pET24a(+)‑hGzmK/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜；再接菌于新的LB培养基中，摇菌至OD600=0.6~0.8之间；然后再加入IPTG诱导表达6h，12000rpm离心2min，去上清后，用PBS重悬菌体，沸水中煮样5min，收集上清得到rhGzmK；以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，通过Western Blot鉴定所述rhGzmK的表达；其中：诱导表达的诱导剂IPTG终浓度为1mM；e）hGzmK重组蛋白的纯化将IPTG诱导表达所获得的pET24a(+)‑hGzmK/BL21菌体离心后，用PBS重悬，然后置于超声波破碎仪中进行超声破碎；破碎后，于4℃、12000rpm，离心15min，检测到rhGzmK主要以包涵体的形式存在于沉淀中；弃去上清后，收集的沉淀用binding buffer尿素溶液重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45μm滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的Ni2+柱进行亲和层析纯化；f）hGzmK重组蛋白的活性鉴定在缓冲液中加入底物溶液Z‑Lys‑SBzl，混匀后加入96孔板中；在含底物溶液的96孔板中加入待测重组蛋白后，加入底物显色液5,5‑二硫代双(2‑硝基苯甲酸)（DTNB），作用10分钟后于酶标仪上读取405nm处OD值。