[发明专利]一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用

摘要

一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用，属于生物化工技术领域。本发明以3-苯氧苯甲酸和对硝基苯丙氨酸为原料，经过2步化学反应，合成拟除虫菊酯类农药的通用包被半抗原，用重氮化法将其和载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用紫外分光光度法进行鉴定和估算偶联物的偶联比。合成的偶联物（包被抗原）用于酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备。通过酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备，证明本发明成功地合成了拟除虫菊酯类农药通用包被抗原，为人们建立拟除虫菊酯类农药的免疫分析方法提供了基础；同时也满足了国内对拟除虫菊酯类农药的快速检测的需求。

主权项

一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成方法，其特征在于以3‑苯氧苯甲酸和对硝基苯丙氨酸为原料，经过2步化学反应，合成拟除虫菊酯类农药的通用半抗原，用重氮化法将其和载体蛋白BSA偶联，用紫外分光光度法进行鉴定；合成步骤为：（1）半抗原的合成①化合物3：N‑(3‑苯氧基苯酰)‑4‑硝基‑L‑苯丙氨酸的合成该反应在N2保护下，将500mg化合物1：3‑苯氧苯甲酸溶于10mL氯仿中，溶解后将其置于冰浴中，然后向其中滴加5μL的DMF和0.33mL氯化亚砜，搅拌5min后撤掉冰浴，然后在65℃油浴中加热1h，旋转蒸发除去氯仿及多余的氯化亚砜，得到无色透明的液体，加入1mL四氢呋喃将其溶解，为a液；接着将480mg化合物2：对硝基苯丙氨酸和380mg碳酸钾溶于10mL水中，为b液；然后在10min内将a液缓慢滴加到强力搅拌下的b液中，反应1h后，用每次50mL乙酸乙酯萃取两次，接着用每次30mL质量浓度0.8%NaCl盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤旋干得到0.5g黄色胶状化合物3，直接用于下步；②化合物4：N‑(3‑苯氧基苯酰)‑4‑氨基‑L‑苯丙氨酸的合成将0.5g化合物3和50mg钯碳Pd/C加入到10mL乙酸乙酯中，在25℃下氢化2h，用薄层层析法监测反应进程，点板显示，原料完全反应时停止反应，过滤除去催化剂，旋蒸得到一灰白色固体，再加入10mL乙酸乙酯稀释，接着在超声波仪中超声10min，过滤得到湿品，红外烘箱下干燥，得到165mg化合物4，即拟除虫菊酯类农药通用包被半抗原；（2）包被抗原的制备①制备A液：称取0.027mmol半抗原化合物4于10mL小瓶中，先滴入几点乙醇将其溶解，然后逐滴加入0.5mL、1mol/L盐酸，溶液会变浑，冷却至0‑5℃，然后逐滴加入现配好的质量浓度30%亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测亚硝酸钠的用量，直到试纸在15s内变蓝为止，停止滴加亚硝酸钠溶液，接着在0℃下搅拌反应45min，得到A液；②制备B液：称取30mg的牛血清白蛋白溶于6mL、0.2M、pH8.8的硼酸盐缓冲液，得到B液；③在冰浴搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，将pH保持在8.5，冰浴下搅拌反应3h，得到包被抗原粗品；④将反应好的包被抗原移入透析袋中，用0.01M、pH7.2磷酸盐缓冲液透析3天，期间更换透析液6‑8次，得到包被抗原：即半抗原‑BSA偶联物；（3）包被抗原用紫外分光光度法进行鉴定。