[发明专利]一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用

摘要

本发明公开了一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用。发酵方法包括以下步骤：（1）宿主菌悬液的制备；（2）蛭弧菌游泳体浓缩液的制备；（3）蛭弧菌制剂的制备。本发明所述的发酵方法中采用的宿主菌均为有益的或对环境无害的革兰氏阳性菌，既可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革兰氏阴性菌的能力，用该方法制得的蛭弧菌制剂对致病菌的裂解能力有了一定的提高；所制得的蛭弧菌制剂又可以直接使用，无需经过更多的发酵后处理，该制剂的使用范围也大大的增加。本发明在得到高浓度蛭弧菌菌液的同时，相对也缩短了发酵周期，这样有效的解决了发酵时间过长而导致的能源消耗过大，生产成本过高的问题，得到的蛭弧菌制剂不仅成本低，而且活性高。

主权项

一种蛭弧菌制剂的发酵方法，其特征在于包括以下步骤：（1）宿主菌悬液的制备：将宿主菌培养至对数生长期，收集菌体，用磷酸盐缓冲液调整浓度，得到浓度为1017～1022cfu/mL的宿主菌悬浮液，然后置于2～15℃中保存备用；所述宿主菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GIM1.136、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）GIM1.80或屎肠球菌（Enterococcus faecium）CGMCC1.2136；（2）蛭弧菌游泳体浓缩液的制备：在磷酸盐缓冲液中加入步骤（1）制备的宿主菌悬浮液，调整宿主菌的浓度为1010～1015cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后将此培养液在20～40℃培养20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm离心15～35min，保留上清液弃去沉淀，然后将上清液在2～15℃，12000～20000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，沉淀为蛭弧菌游泳体，在沉淀中加入磷酸盐缓冲液调整蛭弧菌游泳体的浓度为106～109pfu/mL，得到蛭弧菌游泳体浓缩液，置于2～15℃保存备用；所述蛭弧菌为BDJ02，BDJ02于2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208012；（3）蛭弧菌制剂的制备：将溶剂灭菌，得到发酵培养基；在发酵培养基中加入步骤（1）制备的宿主菌悬浮液和步骤（2）制备的蛭弧菌游泳体浓缩液，使宿主菌起始浓度为1010～1015cfu/mL，蛭弧菌游泳体起始浓度为101～103pfu/mL，进行发酵；发酵温度控制在28～30℃，pH值控制在7.2～7.6；设置搅拌转速与溶氧联动，使溶氧水平控制在20%～30%；发酵过程中加1～3次宿主菌悬浮液，每次加入宿主菌悬浮液的间隔时间12～18h，每次加入宿主菌悬浮液的量以新加入的宿主菌在发酵培养基中的浓度为1010～1015cfu/mL为准；发酵培养36～48h即制成蛭弧菌制剂；所述溶剂为DNB液体培养基、蒸馏水或磷酸盐缓冲液。