[发明专利]荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法

摘要

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。该方法包括猪蓝耳病病弱毒疫苗病毒特异性引物设计、RNA提取、cDNA制备、实时荧光定量RT-PCR扩增、标准质粒构建及检测标准曲线建立、有效性验证和结果判定。外侧引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）用于构建标准质粒，内侧引物（SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4）用于样品检测，内侧引物扩增片段包含于外侧引物扩增片段之内，两对引物均能特异性扩增猪蓝耳病弱毒疫苗株病毒，扩增产物大小分别为287bp和130bp。本方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪蓝耳病病毒弱毒疫苗病毒含量的测定。

主权项

一种荧光定量RT‑PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用于实时荧光定量RT‑PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的特异性引物、标准质粒的制备及建立标准曲线、确定实验的成立标准、确定阳性或阴性的判定标准，其具体特征如下：（1）引物特征：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2能特异性扩增猪蓝耳病病毒的cDNA，扩增产物大小为287bp，用于构建标准浓度的质粒；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4能特异性扩增包含于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增产物片段之内的猪蓝耳病病毒cDNA，扩增产物大小为130bp，用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品；（2）标准曲线的建立方法：提取猪蓝耳病弱毒疫苗的RNA，并反转录为cDNA，作为模板；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，进行PCR扩增；将扩增产物纯化回收，连接到pMD19‑T载体上，转化到感受态细胞DH5α内，提取质粒DNA，获得猪蓝耳病弱毒疫苗检测用的标准质粒；将制备的标准质粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，进行荧光定量PCR，采集荧光信号，使用Bio‑Rad iQ5软件绘制出实时荧光定量标准曲线，并获得其产物Tm值；（3）实验成立标准：若阳性对照的Ct值＜32，阴性对照的Ct值＞35，电脑绘制的标准曲线各点相关度大于95%，反应效率在80%～120%之间，标准浓度质粒样品熔解温度Tm值在85.0±0.5℃则说明实验数据准确、有效，实验成立；（4）判定阳性或阴性的标准：在实验成立的前提下，待测样品的Ct值＜35，Tm值为85.0±0.5℃判为阳性；待测样品的Ct值＞35或Tm值不为85.0±0.5℃则判为阴性。