[发明专利]传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测方法

摘要

传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测方法，它涉及传染性造血器官坏死病病毒的检测方法。它要解决现有的检查传染性造血器官坏死病毒的PCR方法存在敏感性不高的问题。方法：一、设计特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr；二、待检测病料处理后得组织滤液；三、制备IHNV的RNA；四、PCR扩增得扩增产物；五、PCR扩增产物观察，确定结果即完成。本发明具有很好的特异性，不与VHSV存在交叉反应；本发明以聚合酶蛋白作为检测目标，利用特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr进行的检测，操作简单，准确度高、灵敏且低浓度下敏感性很好，检测成本相对较低，与现有巢式PCR(2轮PCR)相比更节省时间。

主权项

传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测方法，其特征在于它按以下步骤进行：一、根据Genbank数据库中IHNV聚合酶蛋白的基因序列(登录号：L40883)，利用Primer Premier5.0选取IHNV聚合酶蛋白的基因保守区段设计一对特异性引物IHNV‑Lf和IHNV‑Lr；二、取无传染性造血器官坏死病临床症状鱼的待检测病料，置于小型匀浆器内，于冰上研磨3‑5min，然后以3000g离心5min，弃去沉淀，上清液经过0.22μM一次性滤器过滤除菌，获得无菌匀浆上清液，再利用MEM培养基将无菌匀浆上清液进行1000倍稀释，获得组织滤液；三、培养瓶中EPC细胞传代长成致密单层细胞后，吸弃培养液后，用Hanks液洗涤2次，接入1mL步骤二中所得组织滤液，置于15℃培养箱中吸附1h，吸弃组织液，加入5mL细胞培养维持液，15℃恒温培养，利用倒置显微镜每日观察细胞病变情况，当70％‑80％的EPC细胞发生病变崩解后，吸取100μL细胞培养液进行病毒的RNA提取，获得IHNV的RNA；四、以IHNV的RNA为模板，IHNV‑Lf和IHNV‑Lr为特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；五、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在825bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在825bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测；其中步骤一中特异性引物的上游引物IHNV‑Lf的核苷酸序列：5’‑CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC‑3’，下游引物IHNV‑Lr的核苷酸序列：5’‑CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT‑3’：步骤三中细胞维持液为含有2％FBS的MEM培养基。