[发明专利]一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法

摘要

本发明属于环境治理技术领域，具体涉及一种利用96孔微平板进行难降解污染物高效菌培养，从而实现菌种的高通量和快速筛选；该方法对从菌种混合体中分离出来的大量单一菌株，在微平板上同时进行培养，并通过染料（MTT或XTT）显色判断菌株代谢进程和对污染物的降解能力，从而筛选出具有较强污染物降解能力的菌株；与传统基于摇瓶培养的菌种筛选方法相比，该方法具有药剂（包括菌剂）消耗量少、培养周期短、仪器设备简单、占用实验空间小、实验工作量小等突出优点；应用该方法后，可实现大批量菌株的高通量快速检测，显著缩短菌种筛选的时间，大幅提高菌种筛选的效率。

主权项

一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，取含有相应污染物高效降解菌的土壤、污泥或生物膜样品，用无菌生理盐水洗涤形成含有混合菌种的菌悬液；步骤2，取上述含有混合菌种的菌悬液，在平板培养基上通过多次划线分离得到多个单一纯菌株，用无菌棉签分别挑取菌落并用无菌生理盐水进行3次洗涤，得到多个含有待测单一菌种的菌液，调节菌液浓度使其在600nm下吸光度（OD600）为0.1‑1.5；步骤3，根据所需处理的难降解污染物溶解度配制饱和的基质母液，并配制氯化铵和磷酸二氢钾组成的无机盐营养液，调节pH至所需范围，其中无机盐营养液中氯化铵浓度为1.0‑3.0g/L，磷酸二氢钾浓度为1.0‑2.0g/L；步骤4，取某一种待测纯菌菌液，将10mL菌液、10mL基质母液和180mL无机盐营养液加入微平板上的某个微孔中，将同样的组分加入相邻的另外2个微孔中，针对同种待测纯菌形成3个平行样；步骤5，重复步骤4的操作，取其他待测纯菌菌液，按顺序加入96孔微平板的相应微孔中，在同一块微平板上，同时设置3个不含菌液和3个不含基质母液的对照微孔；步骤6，在所有微孔中加入10mL浓度为5g/L的噻唑蓝（MTT）显色剂，然后用酶标仪测定各个微孔的OD600作为显色前的初始值；步骤7，将微平板盖好，用封口膜密封后，放入培养箱进行培养，培养温度20‑50℃，培养周期8‑24h，每隔2‑3h，取出平板用酶标仪测定各个微孔的OD600值；步骤8，在培养结束后，按照以下标准判断不同菌株对污染物的降解能力，从而筛选出具有较强污染物降解能力的高效菌：对照微孔内OD600的增加值小于0.05，表明检测结果有效，样品没有受到 污染，在培养结束时，加入菌液和基质的微孔OD600的增加值越大，表明相对应菌株对污染物的降解能力越强。