[发明专利]一种环境水体中CVA16病毒的检测方法

摘要

本发明公开了一种环境水体中CVA16病毒的检测方法。方法中以根据肠道病毒属VP1血清分型区的基因保守片段设计的针对CVA16病毒的引物和探针，制备重组质粒作为标准品，建立了半巢式RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR反应体系，对环境水体中的CVA16病毒进行检测。该方法具有良好的特异性，灵敏度和精密度高，可对环境水体中的CVA16病毒进行准确的定性和定量检测。

主权项

1.一种环境水体中CVA16病毒的检测方法，其特征在于，方法按下述步骤进行：步骤一，样品处理：（1）病毒浓缩：首先在4℃条件下于V mL的待检测水样中加入质量百分比为8%的聚乙二醇和质量百分比为2.3%的氯化钠并混匀，接着将待检测水样在4℃条件下进行离心处理，弃上清液，用1mL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50≤V≤250；（2）RNA提取：使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA；（3）逆转录：将5μL的RNA、2μL的5×gDNA Eraser Buffer、1μL的5×gDNA Eraser Buffer和2μL的RNase Free dH₂O在42℃条件下反应2min得到反应液，将该反应液与4μL的5×Buffer、1μL的RT Enzyme Mix、1μL的RT Primer Mix和4μL的RNase Free dH₂O混合进行反应：先在37℃条件下反应15min；接着在85℃条件下反应5s，得到cDNA；步骤二，定性检测（1）将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的Ex Taq、400nM的上游引物CVA16-F1、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；PCR反应条件为：①95℃预变性5min；②扩增循环35次，每轮循环的反应条件依次为：95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；③在72℃延伸5min，反应产物为PCR产物一；其中：上游引物CVA16-F1的核苷酸序列为：5’-TGGGAYATTGAYTTGATGGG-3’；下游引物CVA16-R的核苷酸序列为：5’-GACATGAAGGGKACTGACACTTG-3’；（2）将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的Ex Taq、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和0.2μL PCR产物一混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：①95℃预变性5min；②扩增循环35次，每轮循环的反应条件依次为：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s；③在72℃延伸5min，扩增产物为PCR产物二；其中：上游引物CVA16-F2的核苷酸序列为：5’-CAAACCRAAYGGTGAGYTAGT-3’；（3）将所得的PCR产物二用含体积浓度2%Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照，并将电泳条带切割胶纯化回收，得胶纯化回收产物；（4）采用双脱氧终止法对所得胶纯化回收产物进行核苷酸序列测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度大于70%时，待检测水样中存在CVA16，继续依次进行后续步骤三和步骤四，否则，待检测水样中不存在CVA16；步骤三，标准品制备：（1）第一轮PCR扩增：以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物CVA16-F1和下游引物CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物；（2）第二轮PCR扩增：以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物CVA16-F2和下游引物CVA16-R为引物进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物；（3）将所得的第二轮扩增后的PCR产物用含体积浓度为2%的Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照确认目的条带，之后切割目的条带并纯化回收，得到目的片段回收产物，该目的片段回收产物的长度为m（bp）；（4）将目的片段回收产物与pMD19-T载体连接转化至大肠杆菌DH5α中，采用蓝白斑筛选法筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃条件下培养12～16小时得到菌液，接着用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒；其中LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL；（5）采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度大于等于90%时，提取的质粒为标准品，当所测得的核酸序列与CVA16病毒基因相似度小于90%时，重复步骤（4）和步骤（5），直至提取的质粒为标准品；（6）检测标准品的OD₂₆₀值n；（7）利用（式1）计算标准品浓度C（copies/μL）：C=n×50×10-9(2962+m)×2×330×6.02×1023]]>    （式1）（式1）中：2962为pMD19-T载体的长度，bp；1OD₂₆₀=50μg/mL的双链DNA；330为1碱基的分子量，g/mol；6.02×10²³为阿伏伽德罗常数，NA；步骤四，定量检测（1）将步骤三得到的标准品依次稀释至多个浓度梯度；利用实时荧光定量PCR分别检测各浓度梯度样品的Ct值和初始模版量x（copies），接着利用测得的七组Ct-x进行线性回归分析，得到标准曲线方程：Ct＝alogx+b    （式2）（式2）中：a和b为标准曲线方程的系数；（2）采用实时荧光定量PCR检测步骤一所获得的cDNA的Ct值：Ct₀；（3）将Ct₀代入（式2）计算待检测水样中CVA16病毒的初始模板量x₀；待检测水样中CVA16病毒的含量C₁（copies/mL）为：C1=x0(20/2)(60/5)(1000/140)V]]>    （式3）。