[发明专利]同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于纳米功能材料、临床分析及生物电化学传感技术领域，提供了一种同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用。所述传感器使用印刷电极集成3个工作电极，可同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物：癌胚抗原、糖类抗原125及糖类抗原15-3，显著提高了检测效率。该免疫传感器的构建过程简单和超灵敏度的优势对临床早期诊断乳腺癌具有重要的科学意义和应用价值。

主权项

一种传感器的制备方法，所述传感器用于三种乳腺癌肿瘤标志物的同时检测，其特征在于，步骤如下：（1）在三通道丝网印刷电极的3个工作电极的表面，分别滴加5~10 µL、浓度为2 mg/mL的石墨烯溶液，室温下自然晾干；（2）在（1）中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5~10µL的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺/N‑羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS溶液，保持湿润、孵化2~3 h，超纯水清洗，晾干；所述EDC和NHS的浓度均为1mg/mL，EDC和NHS的质量比为1~8 : 1；（3）在（2）中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5~10 µL三种乳腺癌肿瘤标志物的一抗溶液中的一种，室温下放置1~2 h，然后4°C下过夜孵化；所述三种乳腺癌肿瘤标志物的一抗溶液的浓度为5~10µg/mL；（4）用超纯水洗去没有交联上的所述的乳腺癌肿瘤标志物的一抗，再滴加质量分数为0.5%~1%的牛血清白蛋白溶液，在37°C下放置1 h，用pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4°C下储存备用；（5）把已知浓度的三种乳腺癌肿瘤标志物的抗原溶液加入到40~60µL、pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液中，各取10~15µL分别滴涂到三个工作电极上，放置1 h；（6）分别滴涂5~7µL 介孔铂纳米粒子标记的三种乳腺癌肿瘤标志物的二抗标记物M‑PtNPs/Ab2溶液到相应的工作电极上，1h后用pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记物，得到组装的工作电极；所述介孔铂纳米粒子M‑PtNPs，制备步骤如下：向6~10mL、20 mmol/L的K₂PtCl₄溶液中，加入聚氧乙烯醚Brij58使其浓度为8.95 ~ 10.95 mmol/L，然后加入6 ~ 10 mL、0.1 mmol/L的抗坏血酸溶液，把混合溶液超声10 ~ 15 min，溶液由慢慢地变浑浊，颜色由黄褐色变成棕褐色，最后变成不透明的黑色后，再高速旋转35 ~ 45 min，离心分离，用超纯水洗涤数次，然后真空干燥，即得到M‑PtNPs；所述M‑PtNPs /Ab2溶液，制备步骤如下：将0.5 ~1.5mg的介孔铂纳米粒子加入1mL、 pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，超声分散后，加入10µg 三种乳腺癌肿瘤标志物的二抗Ab2溶液中的一种，混合溶液在4°C下震荡孵化20~24h，离心分离去除上清液，然后再加入1mL pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，得到三种M‑PtNPs/Ab2溶液，储存在4°C的冰箱中备用；所述三种乳腺癌肿瘤标志物的二抗溶液的浓度为5~10µg/mL；（7）将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入40~60 µL、5~10 mmol/L H₂O₂的pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，然后用差分脉冲伏安法检测组装的工作电极的电流响应，根据所得电流响应与三种乳腺癌肿瘤标志物的抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；（8）将待测样品溶液代替三种乳腺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述三种乳腺癌肿瘤标志物的抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。