[发明专利]基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法

摘要

本发明涉及一种基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法。本发明所述的检测方法是基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增，并利用免疫胶体金作为放大显色系统，以及利用核酸纳米金生物传感器作为核酸量的检测系统，从而实现多重基因分型的目的。与传统的基于PCR技术的核酸分析方法相比，本发明所述的检测方法不需要热循环仪，反应速度快，灵敏度高，检测成本低，而且操作简单，既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测的灵敏度。

主权项

1.一种基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：针对靶标DNA的多态性位点的两种等位基因，配备用于在一次反应中同时分析两种等位基因等温信号扩增反应体系，该体系含有两种发夹DNA探针和相应引物，它们分别对应于各自的靶标等位基因，反应体系为100μl，包含：反应条件为：37℃恒温反应60分钟；在所述的等温信号扩增反应体系中，所述野生型基因发夹DNA探针包括：针对野生型靶标基因设计的识别序列，该识别序列由发夹DNA探针的环序列上游15bp和与此相连的5’端茎序列的8bp构成，总长度23bp，其中5’端上游3bp序列为随机序列5’-TAC-3’；在所述识别序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列5’-GCTGAGG-3’；在切刻酶识别序列的下游是长12bp的茎序列，其中11bp与5’端形成茎状结构，在序列最后加入一个任意碱基，以抑制引物与探针结合后聚合酶延长探针3’端；所述发夹DNA探针的5’端用生物素修饰；在所述的等温信号扩增反应体系中，所述突变型基因发夹DNA探针包括：针对突变型靶标等位基因设计的识别序列，该识别序列由发夹DNA探针的环序列上游15bp和与此相连的5’端茎序列的8bp构成，总长度23bp，其中5’端上游3bp序列为随机序列5’-TAC-3’；在所述识别序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列5’-GCTGAGG-3’；在切刻酶识别序列的下游是长12bp的茎序列，其中11bp与5’端形成茎状结构，在序列最后加入一个任意碱基，以抑制引物与探针结合后聚合酶延长探针3’端；所述发夹DNA探针的5’端用生物素修饰；在所述的等温信号扩增反应体系中，所述野生型基因引物由两部分构成，下游8bp部分是所述野生型基因探针的3’端茎序列中的识别序列的互补序列，下游是10bp的标签DNA序列5’-GTTAGGTAGA-3’；在所述的等温信号扩增反应体系中，所述突变型基因引物由两部分构成，下游8bp部分是所述突变型基因探针的3’端茎序列中的识别序列的互补序列，下游是10bp的标签DNA序列5’-CTATTGCTTG-3’；将等温扩增产物与胶体金-链酶亲和素混合均匀，静置5分钟后，取混合液滴于核酸纳米金生物传感器的样品垫进行检测；所述的核酸纳米金生物传感器包括：从左至右固定于胶板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；硝酸纤维素膜上靠近样品垫一端的地方固定有用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针，形成野生型等位基因检测线；在该野生型等位基因检测线后，固定有用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针，形成突变型等位基因检测线；硝酸纤维素膜靠近吸水纸一端的地方固定有抗链酶亲和素抗体，形成质控线；所述用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针序列是所述野生型引物的标签DNA的互补序列，在该序列的3’加入10个A碱基作为间臂以弱化空间位阻效应；所述用于检测突变型等位基因的寡核苷酸探针序列是所述突变型引物的标签DNA的互补序列，在该序列的3’加入10个A碱基作为间臂以弱化空间位阻效应；结果判定标准是：如果质控线出现红色，而两条检测线任意一条都未出现红色，表明被检样品为阴性，说明核酸提取失败或者扩增反应失败；如果两条检测线或者其中一条和质控线同时出现红色，表明被检样品为阳性；在这种情况下，如果检测线T1出现红色，表明被检样品为野生型纯合子，如果检测线T2出现红色，表明被检样品为突变型纯合子，如果两条检测线出现红色，表明被检样品为杂合子；利用试纸条检测仪器读出检测线和质控线的信号峰面积，对靶标DNA做定量分析。