[发明专利]一种高效构建酿酒酵母HO基因敲除组件的方法

摘要

本发明公开一种高效构建酿酒酵母HO基因敲除组件的方法。该方法首先利用普通PCR扩增得到酿酒酵母HO基因的上、下游同源臂扩增片段以及带有G418抗性标记的kanMX基因扩增片段，再通过降落PCR扩增得到上述三个片段的融合片段，最后利用普通PCR对所述融合片段进行特异性扩增即得酿酒酵母HO基因敲除组件；所述上、下游同源臂扩增片段与所述kanMX基因扩增片段之间存在互补序列。本发明结合降落PCR和普通PCR，成功构建获得高特异性高纯度的HO基因敲除组件，基因片段融合效率高，具有简便、快速、高效的优点，有利于HO基因敲除、酿酒酵母单倍体分离等后续试验的进行。

主权项

一种高效构建酿酒酵母HO基因敲除组件的方法，其特征在于：首先利用普通PCR扩增得到酿酒酵母HO基因的上、下游同源臂扩增片段以及带有G418抗性标记的kanMX基因扩增片段，再通过降落PCR扩增得到上述三个片段的融合片段，最后利用普通PCR对所述融合片段进行特异性扩增即得酿酒酵母HO基因敲除组件；所述上游同源臂扩增片段包括上游同源臂序列及与kanMX基因5’端互补的序列(简称序列A)；所述下游同源臂扩增片段包括下游同源臂序列及与kanMX基因3’端互补的序列（简称序列B）；所述kanMX基因扩增片段包括kanMX基因序列及位于该片段两端分别与上游同源臂序列3’端、下游同源臂序列5’端互补的序列（分别简称序列C和序列D）；所述kanMX基因序列与所述序列C、序列D之间均含有可被Cre重组酶识别的loxp位点；所述序列A、序列B、序列C和序列D均为20～30bp；所述降落PCR扩增反应无引物参与，其扩增条件如下：95℃预变性4～5min，98℃变性10～15s，70℃退火15～30s，每个循环退火温度降低1℃，共15个循环，于72℃延伸2.5～3min，然后于55℃退火温度下再循环一次，最后于72℃再延伸5～10min。