[发明专利]一种利用藻毒素产毒基因研究氮磷对藻毒素生成影响的方法

摘要

本发明提供一种研究氮磷对微囊藻毒素生成的影响的方法。该方法通过对添加不同浓度的氮磷培养铜绿微囊藻，检测微囊藻毒素的量以及微囊藻毒素产毒基因mcyB的拷贝数，建立了不同氮或磷的浓度、微囊藻毒素含量以及藻毒素合成酶基因mcyB拷贝数之间的相关性。从而可以通过检测基因拷贝数来研究藻毒素的含量。本发明建立了一种通过对基因拷贝数的检测来研究氮磷对藻毒素生成的影响的方法。运用该方法检只需要检测产毒基因的拷贝数以及氮磷的浓度即可，所需时间比较短、操作比较简单，所需仪器设备和试剂相对简单。

主权项

一种利用藻毒素产毒基因研究氮磷对藻毒素生成影响的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：A.取不同氮磷浓度条件下培养的10 ml~20 ml铜绿微囊藻的藻液，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液；B.加入1‑5 ml无菌的去离子水，充分混匀，用7000转/分钟离心5分钟，去掉上清液，得到藻细胞；C.利用植物基因组DNA提取试剂盒对步骤B中的藻细胞进行基因提取。D.加入mcyB基因的引物，引物信息如下：F： 5’ ‑ TGGGAAGATGTTCTTCAGGTATCCAA ‑3’R： 5’ ‑AGAGTGGAAACAATATGATAAGCTAC‑3’用DNA聚合酶链式扩增反应（PCR）仪，进行DNA扩增；采用下列参数：95 ℃预变性5 min，随后95 ℃ 30 s，退火温度56 ℃ 30 s和72 ℃延伸45 s，进行30个循环，最终72 ℃延伸10 min。通过1.2 %(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。E.对目标基因进行纯化：利用QIAquick Gel Extraction Kit 凝胶回收试剂盒进行凝胶回收，对目标基因进行纯化，通过1.2%（wt/vol）的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。 F.质粒转化过程：将步骤E中纯化后的DNA插入质粒载体pMD18‑T中，并进一步转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中，随后涂布到加入了IPTG、X‑Gal和Amp的LB固体平板上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。G.利用步骤F中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品。对环境样品进行定量PCR的测定。定量PCR（ABI7300，USA） 采用SYBR greenⅠ 法，选用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒，按照说明书采用20 μl 反应体系，2 μl DNA样品。采用3步法，在定量PCR 仪上进行，95 ℃ 预变性30 s，95 ℃ 15s，退火30 s，温度同普通PCR，72 ℃延伸30 s，此时采集荧光信号，40个循环后，再接溶解程序，95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。标准曲线要求相关系数大于0.99，融解曲线Tm值一致，根据标准曲线确定样品中的DNA浓度。H.藻毒素的提取及定量。取50~100 ml藻液，用溶剂过滤器过滤，滤膜上的细胞用于提取细胞内毒素。滤膜于‑20 ℃下保存。水中藻毒素的提取：采用预先活化的固相萃取C18小柱（使用前用10 ml色谱纯甲醇、10 ml超纯水进行活化，活化过程中C18小柱中的吸附剂不能与空气接触）对滤液进行富 集。然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10%甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用10~20 ml 80 %甲醇溶液分3次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下，定容至0.5 ml，高效液相色谱仪检测。细胞内毒素的提取：采用反复冻融法进行胞内藻毒素的提取。在‑20℃下冷冻，室温下融化，反复三次后，用80 %甲醇溶液振荡提取3次，收集3次溶液，水浴使溶液中的甲醇挥发，经C18小柱富集，然后依次用10 ml超纯水，10 ml 10 %甲醇溶液淋洗C18小柱3次，消除部分杂质，再用10~20 ml 80%甲醇溶液分三次洗脱萃取柱中的藻毒素至浓缩瓶中，经水浴氮吹后浓缩至0.5 ml以下，定容至0.5 ml，高效液相色谱仪检测。I.对步骤G和步骤H的结果进行相关性分析。建立不同氮磷浓度培养的铜绿微囊藻中藻毒素产生量与mcyB基因的拷贝数的关系。J.利用上述藻毒素产生量与mcyB基因拷贝数的关系，可以通过测定mcyB基因拷贝数来确定不同培养条件下藻毒素的产生量。