[发明专利]一种农杆菌介导的快速转基因方法

摘要

本发明涉及一种农杆菌介导的快速转基因方法。步骤如下：（1）试验材料的栽培；（2）农杆菌工程菌转化液的配制；（3）试验材料的预处理；（4）农杆菌浸染；（5）抗性愈伤的筛选；（6）抗性芽的筛选；（7）转基因植株的鉴定。本发明目的在于提供一种在自然环境下的双子叶植物活体转基因方法，能快速获得转基因植株，进行植物的基因工程改良。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作简单，成本低廉，可以在短时间内获得转基因植株。突破了植物组织培养的限制，不依赖于植物基因型，操作简单，工作周期短，成本低廉等优点，能在自然条件下规模化进行植物转基因工作，适用于蕃茄和辣椒等易于形成愈伤的双子叶植物。

主权项

一种农杆菌介导的快速转基因方法，其特征在于，步骤如下：（1）自然环境下试验材料的栽培：在自然环境下种植试验材料，当材料有6片叶子以上且腋芽不高于0.5cm时，开始用作试验受体；（2）农杆菌工程菌转化液的配制：将含有目的基因的农杆菌接种到含有筛选压的液体培养基进行扩大培养，当菌液OD600值达到0.8~1.3时，离心分离菌体，用含有筛选压的AAM液体培养基重悬浮，加入乙酰丁香酮和吐温20，使菌液OD600值为2.5~3.0，农杆菌转化液配制完成，待用；（3）试验受体的预处理：在试验受体所处的环境温度为20℃~30℃、试验受体温度不高于28℃时，去掉顶芽和腋芽，用注射器挫伤或刺伤腋芽处的组织；（4）农杆菌浸染：把（2）中配制好的农杆菌转化液滴在挫伤或刺伤处，再用脱脂棉球沾上农杆菌转化液覆盖在伤口处，其后不间断往脱脂棉球滴加农杆菌转化液，让其保持湿润4小时以上，处理期间受体温度不能超过30℃； （5）抗性愈伤的筛选：当材料伤口上出现1‑2mm大小的愈伤组织时，补加筛选压，抑制愈伤中非转基因细胞的分裂，使转基因细胞正常分裂并分化成抗性芽；（6）抗性芽的筛选：当抗性芽低于1.5cm时，补加筛选压，抑制非转基因愈伤芽的分化，使抗性芽正常生长，及时剪掉未经转化处理的枝条，使抗性芽长成抗性枝条；（7）转基因植株的鉴定；对抗性枝条进行转基因鉴定，结果呈阳性的植株即为转基因植株。