[发明专利]羊牙齿组织总RNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种羊牙齿组织总RNA的提取方法，它由如下步骤组成：用具及耗材的灭菌处理、样本采集与清洗、低温破碎、液氮研磨、裂解细胞、间歇式匀浆、分离DNA和蛋白质、沉淀RNA、洗涤RNA、RNA再溶解后保存于－80℃。本方法具有简单、快速、无需对牙齿进行脱钙、易操作等优点；提取的牙齿总RNA浓度高，纯度好，无需进行RNA纯化，减少了提取步骤，缩短了提取时间；且可以批量提取，可用于实时荧光定量PCR。

主权项

一种羊牙齿组织总RNA的提取方法，其特征在于：它由如下步骤组成：A、用具及耗材的灭菌处理：减少外源RNase污染，将所有实验用具及耗材都先用0.1%的DEPC水浸泡24 h；实验耗材再经高压灭菌处理；B、样本采集与清洗：迅速拔取牙齿后，用灭菌手术刀刮净附着的牙龈等软组织及草垢，再以4℃灭菌生理盐水反复冲洗；C、低温破碎：冲洗后的牙齿用灭菌滤纸吸干水分，迅速放入液氮中进行低温冷冻处理，使得牙齿组织脆化而易于破碎，冷冻24～48 h后取出牙齿，用灭菌锡箔纸或纱布包裹牙齿，用灭菌处理过的铁锤，在液氮存在的情况下，迅速砸碎牙齿；D、液氮研磨：收集铁锤砸碎的牙齿碎块到预先盛有液氮的研钵中，进行研磨；研磨过程中要及时补充液氮；研磨10～15 min，一般臼齿研磨10～12 min，切齿研磨15 min；E、裂解细胞：收集研磨好的牙齿组织粉末80～250 mg，加入到预先加有1～1.2 ml裂解液的预冷5 ml离心管中，于冰上静置20 s；F、间歇式匀浆：选择在冰浴下采用内切式匀浆机进行，转速3000 r/min，间歇性匀浆2～3 min；G、分离DNA和蛋白质：将匀浆完成的裂解液混合物，转入2.0 ml的离心管中，25℃温浴静置5 min，以使核蛋白体完全分解；加入0.2～0.25 ml氯仿，盖紧盖子置于旋涡振荡器上小幅度振荡15s，25℃温浴静置3 min；在温度为4℃条件下，以12000 g的离心力高速冷冻离心15 min，使混合物分离成三层；H、沉淀RNA：收集上层无色的水样层至一新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇，用手摇动使其混匀，25℃温浴静置10 min；在4℃下以12000 g的离心力高速冷冻离心10 min，可见离心管底部附着一胶状小片沉淀即为RNA；I、洗涤RNA：移去上层悬液，加入1 ml 75%乙醇溶液，旋涡振荡洗脱，至片状沉淀飘起，在4℃下以7500 g的离心力高速冷冻离心5 min；J、RNA再溶解：弃去上清液，在超净工作台中自然干燥RNA沉淀5～10 min，加入10 µl的0.1%DEPC处理水，于55～60℃下进行金属浴加热10 min；提取的总RNA分装后保存于－80℃。