[发明专利]一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法无效
申请号: | 201310176245.5 | 申请日: | 2013-05-13 |
公开(公告)号: | CN103266170A | 公开(公告)日: | 2013-08-28 |
发明(设计)人: | 胥传来;尹红红;徐丽广;王利兵;匡华 | 申请(专利权)人: | 江南大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;G01N24/08 |
代理公司: | 无锡市大为专利商标事务所 32104 | 代理人: | 时旭丹;刘品超 |
地址: | 214122 江苏省无*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法,属于纳米生物技术检测领域。本发明包括:磁性纳米粒子分别与上游引物和下游引物偶联,磁性纳米粒子应用PCR进行组装,磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测。本发明提供了一种基于磁性纳米粒子组装体检测DNA的方法,使用引物偶联的磁性纳米粒子,在存在目标DNA的条件下应用PCR对磁性纳米粒子进行不同程度的组装,通过磁性纳米粒子组装体聚集程度的差异,通过磁共振信号对目标DNA进行检测。本发明方法能实现对DNA超灵敏检测,检测限低、检测灵敏度高、特异性好,同时能实现高通量检测的需求。 | ||
搜索关键词: | 一种 基于 pcr 组装 磁性 纳米 粒子 进行 dna 检测 方法 | ||
【主权项】:
一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法,其特征在于包括:磁性纳米粒子分别与上游引物及下游引物偶联,磁性纳米粒子应用PCR进行组装,磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测;具体步骤为:(1)磁性纳米粒子分别与上游引物、下游引物偶联1.3 mg mL‑1的磁性纳米粒子用含137 mM NaCl的0.01M PBS稀释20倍,在1mL稀释好的磁性纳米粒子中,加入0.2 mg 碳二亚胺EDC和0.2 mg N‑羟基硫代琥珀酰亚胺NHS,活化反应15min;活化后的磁性纳米粒子分别加入上游引物、下游引物进行偶联,引物的终浓度均为4μM,室温振荡反应6h;反应物用截留分子量为3000的超滤管进行超滤,除去未偶联的引物,此步骤超滤三次,以保证引物被完全除去;最后截留物用超纯水进行重悬,以得到偶联好的引物修饰的磁性纳米粒子;上游引物:5’‑GAAGGACGAAGGACTCTAACG‑ NH2‑3’,下游引物:5’‑CAATGGCAAAGGATGTTAAACG‑ NH2‑3’;(2)磁性纳米粒子应用PCR进行组装整个PCR反应在50μL的反应体系中进行,其中包含:1×PCR buffer,400μM dNTP,2.5U Taq DNA聚合酶,上、下游引物分别修饰的磁性纳米粒子各2.5μL,目标DNA 1μL,所用的目标DNA的浓度为10倍梯度稀释,分别为10000 fM、1000 fM、100 fM、10 fM、1 fM、0.1 fM、0.01 fM;PCR反应参数为:首先94℃预变性2min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,总共为30个循环;目标DNA:5’‑GAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTG‑3’;(3)磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测将步骤(2)目标DNA不同浓度下得到的磁纳米粒子聚集体加入到微孔板中,应用磁共振信号进行检测,首先测定样品的横向弛豫时间T2,得到横向弛豫时间与目标DNA浓度之间的关系,绘制标准曲线;所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备Niumag‑NMI20‑Analyst,扫描时间参数为:场强为0.5T,中心频率为21.960MHZ,脉冲重复间隔时间TR为3000ms,回波时间TE为200μs,共8个回波;再测定样品的核磁共振成像T2加权像,所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备MiniMR‑60,成像参数为:场强为0.55T,中心频率为23.212MHZ,脉冲重复间隔时间TR为1000ms,回波时间TE为100ms,共8个回波;通过磁共振信号对磁性纳米粒子组装体进行检测,从而间接检测目标DNA含量。
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