[发明专利]一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法

摘要

本发明公开了一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法，包括多伞阿魏ISSR分子标记优化体系的建立、ISSR指纹图谱构建和鉴定方法。具体包括以下步骤：1.多伞阿魏及同属其它品种样品的收集；2.各样品基因组DNA提取方法的比较；3.ISSR-PCR扩增反应条件的优化及电泳检测；4.ISSR分子标记指纹图谱的构建；5.利用构建的一种DNA指纹图谱进行多伞阿魏及同属相似种鉴定。本发明有利于对植株外部形态不易区分的阿魏属品种进行快速、准确的鉴定，且节约了时间和成本，对于保证多伞阿魏药材基源的准确分类鉴别具有重要意义。

主权项

一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法，包括多伞阿魏ISSR分子标记优化体系的建立、ISSR指纹图谱构建及鉴定方法；其特征在于，其具体步骤为：（1）DNA提取：取多伞阿魏及同属三种药用植株上幼嫩叶片，利用试剂盒法提取上述四种药用植物的总DNA；用核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的浓度和纯度；用ISSR分子标记的方法检测所得总DNA的质量；（2）ISSR‑PCR扩增反应及电泳检测：50μl多伞阿魏ISSR反应体系中PCR组分组合为：模板10.5ng、Taq酶1.55U、dNTP0.2mM、引物0.4μM、Mg2+1.0mM；扩增程序为95℃预变性1min，依据引物Tm值‑3℃原则、50‑56℃退火35s，72℃延伸80min，共45个循环；72℃延伸10min；4℃保存；琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，放入TAE中染色，然后在凝胶成像仪上观察、拍照并记录；（3）ISSR分子标记指纹图谱的构建：对提取样品的基因组DNA进行100条ISSR引物扩增实验，选择扩增稳定、条带清晰、多态性较高的15条引物的扩增产物进行条带统计；根据照片上各材料各引物扩增情况作记录，有带记为1，无带记为0，按Nei的方法计算多伞阿魏及同属相似种间的相似系数；利用Popgene32软件分析遗传结构和遗传多样性指数，并根据遗传距离，用NTSYS‑PC软件的对不同居群进行聚类分析，构建多伞阿魏及同属相似种ISSR指纹图谱库；（4）利用构建的一种DNA指纹图谱进行多伞阿魏鉴定：将待鉴定的多伞阿魏样品在上述条件下所建立的ISSR指纹图谱与已构建的多伞阿魏ISSR指纹图谱相比较，与所建立ISSR指纹图谱不同的，即为其它品种；相同的即为多伞阿魏。