[发明专利]一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法

摘要

本发明涉及运用Red重组系统对目的菌株的相关基因进行敲除，获得新的突变体。具体为涉及以布洛芬降解克隆菌株3G7的Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5（该2株突变体中的Tn5插入位点在邻苯二酚2,3-双加氧酶基因内）为出发菌株，借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7电击转化至另一克隆菌株4F6，敲除4F6菌株中的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，获得新的转座子突变体4F6-G9和4F6-H5。

主权项

一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：（1）以福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7为出发菌株，构建其Tn5转座子插入突变株3G7‑G9和3G7‑H5；（2）使用布洛芬邻苯二酚2,3‑双加氧酶基因（Ipf C23O）正反向引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7‑G9和3G7‑H5中的Ipf C23O基因来对步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7‑G9和3G7‑H5进行Tn5插入片段的检测，以确认突变体中该转座子的存在；（3）以福斯质粒文库克隆菌株4F6为备选菌株，制备福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞；（4）将λ‑red同源重组酶质粒pKD46高压电击转化至上述步骤（3）得到的福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞中，于添加氯霉素和氨苄青霉素的LB双抗平板筛选到阳性转化子4F6‑pKD46菌株；（5）以步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7‑G9和3G7‑H5为模板,使用ipf23O F和R引物分别PCR扩增出突变体G9和H5中的线性DNA；制备步骤（4）所得到的阳性转化子4F6‑pKD46菌株的感受态细胞，将所得线性DNA高压电击转化至感受态受体细胞4F6‑pKD46菌株中，于添加氯霉素和四环素的LB双抗平板筛选新的阳性转化子4F6‑G9和4F6‑H5菌株；（6）消除步骤（5）所得的阳性转化子4F6‑G9和4F6‑H5菌株中的重组质粒pKD46；使用ipf23O F和R引物，通过菌落PCR再次确认4F6‑G9和4F6‑H5突变体；（7）对步骤（1）和步骤（6）所得的Tn5转座子插入突变株3G7‑G9、 3G7‑H5、4F6‑G9和4F6‑H5以及步骤（1）中的原始出发菌株3G7和4F6进行间位苯环裂解活性（MC）测定。