[发明专利]用汉逊酵母表达系统产生HPV33L1蛋白的方法

摘要

本发明涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV33L1蛋白的方法。具体地，本发明公开了产生表达HPV33L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法以及由所述方法产生的重组汉逊酵母细胞。本发明还公开了利用所述重组汉逊酵母细胞产生HPV33L1蛋白的方法以及所产生的HPV33L1蛋白在制备预防性疫苗中的用途。

主权项

1.一种产生HPV33 L1蛋白的方法，包括以下步骤：a).产生表达人乳头瘤病毒33型L1(HPV33 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞；b).在适于所述HPV33 L1蛋白表达的条件下培养a)中获得的重组汉逊酵母细胞；和c).从培养物中回收并纯化所述HPV33 L1蛋白；其中a)中通过包含以下步骤的方法产生表达人乳头瘤病毒33型L1(HPV33 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞：a1)通过将包含与MOX启动子和MOX终止子可操纵地连接的SEQ ID NO:2所示的HPV33 L1蛋白编码序列的外源多核苷酸插入序列示于SEQ ID NO:9的载体来构建表达构建体；a2)用步骤a1)中获得的表达构建体转化ATCC26012汉逊酵母细胞；和a3)用Zeocin和G418对步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有拷贝数大于60的所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞；其中b)中的培养包括以下步骤b1)和b2)：b1)制备发酵种子液：取所述重组汉逊酵母细胞50μl接入5ml YPD培养基中，于30℃、200rpm摇床培养20‑24hr，A_600nm2‑5，各吸取1ml接入2瓶500ml YPD培养基中，于30℃、200rpm摇床培养20‑24hr至A_600nm15‑20，作为发酵种子液待用；b2)发酵：500ml发酵种子液加入至30L发酵罐中的发酵起始培养基，发酵体积为15L；起始搅拌转速为200rpm、空气流量0.5Nm³/hr、罐压0.5bar，发酵中控制溶氧值为20‑80％；起始生长期维持25hr后，菌液A_600nm达到20，溶氧开始快速上升，开始以100ml/hr流速流加补料培养基；培养6‑8hr后，菌液A_600nm达到90，停止流加，氨水调节pH值至6.0；溶氧开始回升后开始流加含12ml/L PTM1的甲醇进入诱导表达期，诱导温度设定为35℃，甲醇初始流加速率为50ml/hr，每小时取样，甲醇电极测定甲醇浓度，通过调节甲醇流加速率使甲醇浓度控制在＜5g/L；诱导10hr后下罐，4℃条件下以5000rpm离心30min收集湿菌体，‑20℃冻存备用；其中c)中的回收和纯化包括以下步骤c1)和c2)：c1)取‑20℃保存的HPV33‑L1表达湿菌体，按照10ml/g湿菌体的比例加入0.9％生理盐水清洗；菌体洗涤后，按20ml缓冲液/g湿菌体加入破碎缓冲液充分溶解，使用高压匀浆破碎，破碎压力1500bar，循环破碎5‑8遍，镜检破碎率＞90％；菌体破碎液在4℃条件下以10000rpm离心30min，收集上清液；c2)经1μm过滤的菌体破碎上清液，上样于层析介质POROS XS，用0.5M～1.5M NaCl梯度洗脱，收集洗脱的HPV33 L1蛋白；将初步纯化后的HPV33 L1蛋白上样于层析介质Macro‑Prep陶瓷羟基磷灰石，目的蛋白结合于层析介质上，用20～200mM磷酸盐浓度梯度洗脱，目的蛋白与杂质分离，收集洗脱的HPV33 L1蛋白。