[发明专利]一种人表皮干细胞的分离和培养方法

摘要

本发明提出了一种人表皮干细胞的分离和培养方法，涉及细胞的分离和培养。它通过0.25%Try在4℃条件下冷消化4-8小时进行传代培养，与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明中的分离和培养方法，得到的细胞活力高，细胞活力由传统消化方法的77%提高到90%以上；而且活细胞数多，活细胞数由传统消化方法的0.9×105/ml提高到1.8×105/ml，传代培养时贴壁效果良好，细胞贴壁率由62%上升至88%；同时，利用传统的消化方法消化表皮干细胞后，细胞一般只能传2-3代；利用本发明后，细胞一般能传6-8代，传代次数也得到了提高。

主权项

一种人表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将取下的人包皮标本用酒精浸泡，然后用酒精棉球擦拭，再用PBS平衡盐液冲洗；（2）将PBS平衡盐液冲洗后的人包皮标本剪去皮下组织，并将人包皮标本剪成长方形的条状，然后进行分离消化；（3）将消化后的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗；（4）将PBS平衡盐液漂洗后的人包皮标本的表皮和真皮进行分离；（5）将分离后所得的表皮进行消化；（6）将消化后的表皮进行离心过滤，弃去上清液，并将离心过滤后的表皮放入K‑SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5×104/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，28‑32min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天更换K‑SFM培养液；（7）待细胞融合大于70%后，进行传代培养，包括下列步骤：a、弃去细胞培养液，磷酸盐缓冲液洗涤2‑3遍；b、每孔加入0.25%Try各0.8‑1.2ml后放入冰箱，保持温度2‑6℃；c、待2‑12h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10%FBS的DMEM中和；d、将液体吸入离心管中，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养板后移入离心管中，在800‑1200rpm/s，离心5‑8min；e、弃去上清液，加入K‑SFM培养基重悬细胞，所述K‑SFM培养基按K‑SFM培养基与细胞的体积比2.5‑3.5:1加入，重悬细胞后，计算细胞数，将细胞按5×104/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，28‑32min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数，计算贴壁率。