[发明专利]一种用于增强聚焦超声疗效的靶向EGFR氟碳纳米粒的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于增强聚焦超声疗效的靶向EGFR氟碳纳米粒的制备方法，包括制备生物素化脂质氟碳纳米粒；制备生物素化尼妥珠单克隆抗体；制备靶向EGFR氟碳纳米粒。采用本方法所制备靶向EGFR脂膜氟碳纳米粒表面光滑呈球形，颗粒规则无粘连，粒径在200～500nm之间,可与胰腺癌肿瘤细胞表面的EGFR特异性结合，能够在聚焦超声作用下发生液气相的转变，增强聚焦超声的疗效；本发明合成的产物能够与肿瘤细胞表面EGFR特异性结合，并可在超声作用下发生液气相转变并破裂，其产生的空化效应可以损伤肿瘤血管内皮细胞，并对肿瘤细胞起到抑制和杀伤作用，从而达到对聚焦超声治疗的增效作用。

主权项

一种用于增强聚焦超声疗效的靶向EGFR氟碳纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备生物素化脂质氟碳纳米粒：a、将二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二棕榈酰基磷脂酸DPPA、生物素化DSPE‑PEG2000‑BIOTIN，按照质量比为50:2:5的比例加至丙二醇中，搅拌加热，70℃下上述脂质混合物溶解，脂质混合物的质量浓度为0.5%～0.6%；b、当脂质混合物溶解后，逐滴加入体积比为8:1的生理盐水与甘油的混合溶液，生理盐水与甘油的混合溶液与丙二醇体积相同；c、将步骤b得到的脂质混合溶液与全氟戊烷C₅F₁₂按体积比3:1混合，匀化处理制得粒径为200～500nm的生物素化脂质氟碳纳米粒；（2）制备生物素化尼妥珠单克隆抗体：d、将长臂生物素酯NHS‑LC‑BIOTIN以1mg／ml溶于二甲基亚砜DMSO中，尼妥珠单克隆抗体以lmg／ml溶于PBS缓冲液中；e、按摩尔比30:1将NHS‑LC‑BIOTIN和尼妥珠单克隆抗体混合，并在室温下轻晃反应1h，使抗体与生物素酯充分交联；f、将步骤e中的混合液移至滤膜管，将滤膜管放置于高速离心机中离心去除未结合的NHS‑LC‑BIOTIN，滤膜管内存留的即为生物素化尼妥珠单克隆抗体；（3）制备靶向EGFR氟碳纳米粒：g、将步骤（1）制备得到的生物素化脂质氟碳纳米粒加入PBS溶液中稀释后，缓慢滴加到亲和素SA溶液中，亲和素SA溶液中亲和素SA与DSPE‑PEG2000‑BIOTIN等摩尔量，在恒温振荡器中缓慢振摇充分孵育；h、将经过孵育的纳米粒混悬液离心去除上清液以除去游离的SA，然后加入PBS缓冲液漂洗，重复离心去除上清液至少三次；i、将亲和素、生物素化脂质氟碳纳米粒及生物素化尼妥珠单克隆抗体三者按照等摩尔比进行混合，避光以缓慢振摇充分孵育后，最终获得携带EGFR单克隆抗体的靶向氟碳纳米粒。