[发明专利]测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法。该方法包括：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和B细胞；分别统计、测量它们的细胞数目和总面积；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将A细胞置于其中培养；后检测A细胞荧光淬灭前的平均荧光值；再加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测A细胞荧光淬灭后的平均荧光值；再用同样的方法检测B细胞荧光淬灭前的平均荧光值和淬灭后的平均荧光值；再从待测胰岛细胞团中取出一部分胰岛细胞团作为检测样本，用同样的方法检测其荧光淬灭前的荧光值和淬灭后的荧光值；根据下列公式得到结果。本发明的方法可以在活细胞中进行，从而实现无损检测的目的。

主权项

1.测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤A：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和多个B细胞；步骤B：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B细胞的总面积S₂；步骤C：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述m个A细胞置于该培养基中，培养；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;步骤D：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述n个B细胞置于该培养基中，培养；后检测所述n个B细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂;步骤E：再从待测胰岛细胞团中取出一部分胰岛细胞团作为检测样本；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述检测样本置于该培养基中，培养；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值a；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;步骤F：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞的数目比例R： R = b 2 a - ba 2 ba 1 - ab 1 × mS 2 nS 1 ; ]]>其中，所述锌离子荧光染料为对所述A细胞和所述B细胞荧光染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料；操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为16-37℃。如权利要求1所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述锌离子荧光染料为红色内酰胺锌离子染料。如权利要求2所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述非荧光素锌离子络合剂为N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺。如权利要求3所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述步骤C至所述步骤E中加入的红色内酰胺锌离子染料的浓度为：8-12μmol/L；所述步骤C至所述步骤E中加入的N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺的浓度为：0.8-1.2mmol/L。如权利要求4所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述步骤C至所述步骤E中所述培养的时间为0.8-1.2h；所述步骤C至所述步骤E中所述静置的时间为15-25min。如权利要求5所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述步骤C至所述步骤E中加入的红色内酰胺锌离子染料的浓度为：10μmol/L；所述步骤C至所述步骤E中加入的荧光素锌离子络合剂为N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺的浓度为：1mmol/L；所述步骤C至所述步骤E中所述培养的时间为1h；所述步骤C至所述步骤E中所述静置的时间为20min。如权利要求1-6任一项所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述胰岛培养基为洛斯维·帕克纪念研究所RPMI培养基，且所述培养基含有0.1g/mL小牛血清。如权利要求1-6任一项所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述步骤C至所述步骤E中检测荧光值的方法为：采用宽场显微镜检测或共聚焦显微镜检测。如权利要求1-6任一项所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为25-37℃。如权利要求9所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述m≥6；所述n≥6。