[发明专利]赋予植物耐寒性的一个棉花P型ATP酶基因Gbpatp的应用

摘要

本发明涉及一个赋予植物耐寒性的P型ATP酶基因Gbpatp的应用，属于生物技术领域。Gbpatp基因是从海岛棉品种H7124（Gossypiumbarbadense）中获得的一个P4-ATPase,该基因含有跨膜区、ATPase区以及水解酶区。该基因受低温诱导后表达量显著增加，沉默该基因可以显著降低受体植株的耐低温能力。Gbpatp转基因植株可以显著提高受体植物对低温的耐受力。Gbpatp基因的分离可以进一步丰富抗性基因资源，有助于更好地了解耐低温基因的作用机制，可将该基因应用于抗寒育种。

主权项

赋予植物耐寒性的一个棉花P型ATPase基因Gbpatp的应用，包括：以测序正确的克隆质粒T‑easy‑Gbpatp为模板，经引物P1   ATGGAGCTGCATAACAACGP2   TTAACTGGAATCTTCATCTGGC高保真酶Ex Taq进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火50s，72℃延伸4min，35个循环；72℃加A10min；PCR产物按Axygen公司PCR纯化试剂盒说明书纯化后，依据TA克隆法将Gbpatp基因全长连接到PCXSN上，采用冻融法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，培养在含有卡那霉素50 mg/L的LB固体培养基上，37℃培养16h～20h，挑取单克隆菌落于含有卡那霉素50 mg/L液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养14h，提取质粒，用载体引物pCXFP9  CGAATCTCAAGCAATCAAG及基因的反向引物P2进行PCR筛选3669bp大小片段，阳性克隆命名为PCXSN‑Gbpatp，用冻融法将PCXSN‑Gbpatp转化农杆菌LBA4404，转化子经PCR验证后保存备用；随机挑取合适的农杆菌转化子，进行PCR验证，吸取含有阳性克隆的菌液20μl加入到含卡那霉素50 mg／L，利福平50 mg／L 的50ml液体LB培养基中，28℃、130 r／min培养过夜至OD600为0.5，采用叶盘法侵染普通烟草，将侵染过的叶片放于培养基MS+2mg/L6‑BA+0.2mg/LNAA+cef500mg/L上，黑暗处共培养2天后,将叶片转移至筛选培养基MS+2mg/L6‑BA+0.2mg/LNAA+cef500mg /L+hyg15上，经过筛选后，对所得再生植株，用PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达；经分子鉴定后，获得Gbpatp基因过量表达的烟草T1植株。