[发明专利]抗菌化合物高通量筛选方法及应用

摘要

本发明属于兽医微生物学和兽药学技术领域。具体涉及一种抗菌化合物高通量筛选方法及应用。以对6种抗生素有抗性的胸膜肺炎放线杆菌分离株HB0503作为靶标菌，以四环素为阳性对照，利用不透明的96孔板为筛选载体，用化学发光法测定活细菌数，鉴定化合物的抗菌效果。根据高通量筛选方法质量判定标准，分别计算了细菌比浊法、化学发光法，确定化学发光法为优选方案，鉴定出八种化合物对胸膜肺炎放线杆菌耐药菌株具有抑制活性，其中四种化合物对副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪链球菌2型和金黄色葡萄球菌也具有较好的抑菌活性。

主权项

1.基于化学发光法的抗菌化合物高通量筛选方法，其特征在于，以胸膜肺炎放线杆菌HB0503菌株为靶标菌，以四环素为阳性对照，用BacTiter-Glo^TMMicrobial Cell Viability Assay试剂检测靶标菌数量；其步骤如下所示：(1)在不透明96孔板的第二列加入96μL TSB培养基，在第3-9列分别加入50μL TSB培养基，分别在第二列加入4μL若干待筛选化合物，并依次倍比稀释至第9列，在最后一列弃去50μL混合均匀的TSB培养基；在第10列设置无化合物的阴性对照组，在第11列设置四环素阳性对照组，在第1列和第12列各孔中分别加满灭菌水以防止板内液体的蒸发；(2)在每个孔中加入50μL含有10⁵CFU的复苏后的靶标菌胸膜肺炎放线杆菌HB0503菌液；(3)将步骤(2)中的96孔板置于37℃，180r/min摇床上培养5h后，加入100μL BacTiter-Glo^TM试剂反应10min，在化学发光检测仪上检测化学发光值；(4)采用下列公式计算待测抗菌化合物的抑菌率：待测抗菌化合物的抑菌率＝(无化合物的阴性对照组化学发光平均值-化合物组化学发光值)/无化合物的阴性对照组化学发光平均值；(5)将检测的化合物与已知化合物库进行比对，筛选得到如下所示的抑菌化合物：1)A111：放线酰胺素，3-[[1-[(2-(Hydroxymethyl)-1-pyrrolidinyl)carbonyl]-2-methylpropyl]carbamoyl]octanohydro xamic acid；其结构式为：对应的分子量为385.5；2)L65：喷他脒羟乙磺酸盐，4′4-[1，5-Pentanediylbis(oxy)]bis-benzenecarboximidamide isethionate，其结构式为：对应的分子量为592.68；3)E85：二苯基氯化碘盐，[1，1′-Biphenyl]-2，2′-diyiodonium chloride，其结构式为：对应的分子量为314.55；4)G76：5-氟脲嘧啶，5-Fluorouracil，其结构式为：对应的分子量为130.08；5)N91：6-硝基苯[b]噻吩-1，1-二氧化物，6-Nitrobenzo[b]thiophene-1，1-dioxide，其结构式为：对应的分子量为211.09；6)M63：1，10-菲咯啉一水合物，1，10-Phenanthroline monohydrate，其结构式为：对应的分子量为198.22；7)M85：N7-[(1′R，2′S，3′R，4′S)-2′，3′-二羟基-4′-氨基环戊基]-4-氨基-5-碘代吡咯嘧啶二盐酸盐，N7-[(1′R，2′S，3′R，4′S)-2′，3′-dihydroxy-4′-aminocyclopentyl]-4-amino-5-iodopyrrolopyrimidine dihydrochloride hydrate，其结构式为：对应的分子量为448.09；8)M96：(E)-3-(4-甲基苯磺酰)丙烯腈(E)-3-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-propenenitrile，其结构式为：对应的分子量为207.25。