[发明专利]一种提取和浓缩Ⅱ型胶原的方法

摘要

本发明提供一种提取和浓缩II型胶原的方法，包括初步提取II型胶原蛋白，和通过乙酸溶胀胶原，调整胶原溶液至中性，通过13000r/m、14000r/m和15000r/m三次递增转速离心得到高浓度的II型胶原。

主权项

一种提取和浓缩II型胶原的方法，包括以下步骤：(1)超净台中用手术刀剔取猪膝关节中透明的关节软骨，超纯水冲洗5次，95％的乙醇浸泡组织脱脂10min，超纯水冲洗5次；(2)称取步骤(1)的关节软骨，粉碎组织放入10倍体积4M的盐酸胍(pH7.5)，搅拌24h，4℃操作；(3)将步骤(2)的溶液搅拌过滤，留取滤液，15000r/m，30min离心，留取上清液，NaOH调整pH值至中性，4℃操作；(4)将步骤(3)的上清液于12000r/m，30min离心，收集沉淀组织，用超纯水透析，4h更换一次超纯水，透析36h；(5)向透析后的沉淀组织加入10倍体积的0.05mol/L乙酸和胃蛋白酶进行酶解，4℃搅拌72h；(6)将步骤(5)的溶液过滤，收集滤液，15000r/m，30min离心，留取上清液用NaOH溶液调整pH值至中性，4℃静置24h；(7)将步骤(6)的上清液于12000r/m，30min离心，收集胶原沉淀，用超纯水透析，4h更换一次超纯水，透析36h，冻干形成II型胶原，干燥4℃冷藏备用；(8)称取制备好的II型胶原膜1000mg，溶于0.05mol/L乙酸，4℃搅拌24h，待胶原溶液完全溶解后，用100目滤网过滤胶原溶液；(9)用NaOH溶液调整胶原溶液pH值至中性，13000r/m，10min离心，倒出上清液继续低温高速离心，14000r/m，10min，然后倒出上清液，继续低温高速离心，15000r/m，10min，收集三次离心的上清液，计算II型胶原浓度，取出胶原沉淀平铺在培养皿中，冻干形成II型胶原膜，干燥4℃冷藏备用。