[发明专利]一种制备丙酮酸氧化酶的方法

摘要

本发明涉及一种制备丙酮酸氧化酶的方法，包括：（1）含丙酮酸氧化酶的微生物细胞培养、离心收集菌体细胞、细胞破碎；（2）配制聚乙二醇/无机盐双水相萃取体系溶液；（3）利用双水相萃取体系进行三次萃取分离，得到含有丙酮酸氧化酶的无机盐溶液；（4）超滤膜过滤浓缩，截留液冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶产品。本发明可以实现丙酮酸氧化酶制备的连续化、规模化，并且酶的制备工艺简便，生产周期短，操作条件温和，酶活力回收率高，丙酮酸氧化酶的生产成本较低。

主权项

一种利用双水相萃取体系制备丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步骤：（1）将含丙酮酸氧化酶的微生物细胞进行培养，得细胞培养液，离心，制得湿菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞悬浮液，破碎细胞，得到细胞破碎液；（2）配制无机盐水溶液，向该无机盐水溶液中添加聚乙二醇，在总体系中无机盐的质量百分比浓度为10～20wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为20～30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/无机盐双水相体系溶液；（3）向步骤（1）制得的细胞破碎液中加入步骤（2）制得的聚乙二醇/无机盐双水相体系溶液，双水相体系溶液与细胞破碎液的体积比为1：（1～2），混合均匀，静置分相，制得无机盐下相溶液和含有丙酮酸氧化酶的聚乙二醇上相溶液；（4）向步骤（3）制得的聚乙二醇上相溶液中加入无机盐，使无机盐在总体系中的质量浓度为6～10wt%，混合均匀，静置分相，制得二次分离的无机盐下相溶液和含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液；（5）向步骤（4）制得的聚乙二醇上相溶液中加入无机盐，使无机盐在总体系中的质量浓度为5～6wt%，调节溶液的pH值为5.5～6.0，混合均匀，静置分相，制得含有丙酮酸氧化酶的无机盐下相溶液和聚乙二醇上相溶液；（6）将步骤（5）制得的含有丙酮酸氧化酶的无机盐下相溶液，采用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶。