[发明专利]一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法及应用

摘要

本发明公开了一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法及应用，方法易行，操作简便，共转化毛状根诱导频率高，离体毛状根可在MT基本培养基上自主生长，生长条件容易控制，实验观察方便，该毛状根体系因为含有DR5::YFP:GUS报告基因，且DR5启动子受生长素诱导表达，因此可以根据YFP荧光和GUS染色结果直观的观察毛状根生长和发育过程中内源生长素的分布和表达模式；克服了枳根系发育研究常规方法中存在的诸如根系生长在土壤中，观察、取材不便，生长环境难以控制等问题。

主权项

一种利用发根农杆菌高效诱导枳产生毛状根的方法，其步骤如下：（1）剥取枳果实种子，1M NaOH 浸泡10min去除果胶，蒸馏水漂洗3－5次后3%次氯酸钠消毒20min，灭菌蒸馏水漂洗3次，去掉内外种皮后播种于MT播种培养基，24‑26℃暗处培养30‑45d获得无菌苗，取出1500－2000lx光照强度下光照5‑7d左右，转绿后挑选健壮无菌苗，将上胚轴切成1.5cm，待用；（2）利用电转化方法将含DR5::YFP:GUS的双元表达载体质粒导入发根农杆菌MSU440，获得含双元载体的发根农杆菌；（3）挑取活化后的发根农杆菌单菌落，在含50mg/L 壮观霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养36－48h，用手术刀片刮取培养好的菌体于添加了20mg/L乙酰丁香酮的MT悬浮培养基中，180rpm、28℃振荡培养1.5－2h后将菌液OD600值调整至0.6－0.8，待用；   （4）将无菌苗上胚轴切段转至含发根农杆菌的MT悬浮培养基中，浸泡20－30min，期间轻轻摇匀2－3次；（5）无菌滤纸吸干多余菌液后转至含20mg/L乙酰丁香酮的 MT共培养培养基中，21℃ 暗处共培养3－4d；（6）取共培养结束的外植体，灭菌蒸馏水漂洗3次，无菌滤纸吸干后转至含50mg/L卡那霉素及400mg/L头孢霉素的毛状根诱导培养基上, 24‑26℃ 暗处培养14d左右可见白色毛状根从上胚轴切段伤口陆续发出；（7）当毛状根长至2cm，切取1.5cm左右含根尖部分毛状根继代于含400mg/L头孢霉素 MT基本培养基中，20d继代一次，继代2－3次即可获得无菌的毛状根；所述的培养基配方如下：MT播种培养基：MT+25g/L 蔗糖+8g/L 琼脂MT悬浮培养基：MT+0.5g/L麦芽提取物+1.5g/L谷氨酰胺+40g/L蔗糖+20mg/L乙酰丁香酮MT共培养培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+20mg/L乙酰丁香酮毛状根诱导培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+50mg/L 卡那霉素+400mg/L+头孢霉素LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L；所述的DR5::YFP:GUS的双元表达载体质粒，其构建过程是：DR5由7个11bp的5'‑CCTCGTGTCTC‑3'串联重复组成；内切酶XhoⅠ和NotⅠ酶切SlIAA14：：GUS + YFP载体并回收，将DR5序列用T4 DNA 连接酶连接入回收载体，即构建出DR5::YFP:GUS双元表达载体。