[发明专利]虎眼万年青干细胞系形成层与抗癌组合物的提取制备方法

摘要

本发明提出了虎眼万年青干细胞系形成层与抗癌组合物的提取制备方法。根据本发明形成层来源的干细胞无分化状态，从而在长期培养时细胞生长与模式无变异地稳定的被维持而可大量的培养。通过乙醇提取，离心分离，旋转低温真空浓缩，真空冷冻干燥后，制备的口服液剂型、饮料等剂型的功能性抗癌食品，可对二十多种不同特异性的肿瘤细胞具有强烈的抑杀活性。同时对预防变异细胞转癌有较好的抑制作用，还具有抗氧化、降脂降糖、降低胆固醇、抗辐射、提升免疫力，激活受损的DNA有较好的功能性作用。

主权项

1.本发明虎眼万年青干细胞系形成层与抗癌组合物的提取制备方法。1、离体材料的制备优选生长4年的虎眼万年青球茎，水冲洗球茎表面的附着物及泥土等杂质放入110mg、L-抗坏血酸和1％L的苯菌灵混合溶液中杀菌处理10分钟，然后用无菌磁化水洗涤10分钟，在放入75％的乙醇液中杀菌1分钟，在放入30％的过氧化氢液中杀菌20分钟，然后再用无菌蒸馏水冲洗10分钟。2、固态培养基的制备方法(1)硝酸钾2510mg，硫酸胺136mg，硫酸镁123mg，硫酸锰10mg，硫酸锌2.5mg，硫酸铜0.026mg，氯化钙114mg，碘化钾0.7mg，氯化钴0.026mg，磷酸二氢钠131mg，硼酸2.8mg，钼酸钠0.26mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg。肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，L-抗坏血酸52mg，柠檬酸74mg。L-天冬氨酸135mg，L-精氨酸176mg，甘氨酸76mg，脯氨酸116mg，α-萘乙酸2.2mg，蔗糖10.100mg，活性炭200mg，琼脂3.100mg，磁化水0.63升。(2)将无机盐类各养分分别用20ml磁化水稀释，将维生素类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将氨基酸类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将生长素放入10ml无菌磁化水中稀释。然后将稀释后的无机盐类分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类、固化剂、活性炭放入，全部溶解后，封口，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素和氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝。3、离体材料诱导及形成层分离培养(1)将灭菌的虎眼万年青球茎用接种刀切成4段，去掉最外层，取第二层和第三层的内包层，分别切成1-2cm的小方块，移入培养基中，在受控的暗室内避光培养28天，培养温度25±1℃。培养28天后，将形成层细胞群体用接种勺或接种铲轻轻将其移入另一同样培养基烧瓶内在放大培养23天。(2)然后在将其放大培养的细胞系群体移入液态培养基中，在暗室中，用旋转摇床以100rpm，25±1℃培养，传代时间为20天。4、液态培养基的制备方法按表1固态培养基的制备方法制作硫酸镁181mg，硫酸锰23mg，硫酸锌8.9mg，硫酸铜0.23mg，硝酸钙473mg，硝酸胺400mg，氯化钙60mg，碘化钾995mg，钼酸钠0.24mg，硼酸6mg，磷酸氢钠170mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，L-抗坏血酸60mg，柠檬酸75mg。L-天冬氨酸135mg，L-精氨酸178mg，甘氨酸75mg，脯氨酸116mg，α-萘乙酸2mg，蔗糖30.100mg，麦饭石颗粒50000mg，锗石50000mg，磁化水1升。5、生物反应器内培养将来自虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系在烧瓶的干细胞移入10升的气升式生物反应器内放大培养，培养基用表2中的液态培养基放大培养10天后，再向内加入蔗糖10g和甲基茉莉酮酸酯1mg，无菌磁化水0.5升的混合液再继续培养10天。6、细胞系的提取分离(1)将培养液用1um的过滤器过滤，滤去培养液，收集截留的细胞系黏液质，放入一不锈钢容器内封口，放入35℃冰箱内预冻2小时后，在放进液氮罐内冷冻3小时。取出，在室温下维持30分钟后，在依次预冻、冷冻2次，共计冷冻3次。(2)将冷冻3次的容器取出，室温下维持10分钟后，快速粉碎成60目粗冻粉，之后放入80％的500ml乙醇中间接加热20℃搅拌48小时，然后放入离心机内以3.000rpm离心20分钟，取上清液。(3)将离心机内乙醇不溶物取出，在加入100ml乙醇液，放进40HZ超声波清洗机内，超声振荡10分钟，在依次离心20分钟，取上清液。(4)将两次的离心上清液合并，通过旋转式低温36℃真空蒸发器内蒸发浓缩至原体积十分之四左右时，取出，进行低温冷冻真空干燥，即得所述的虎眼万年青干细胞乙醇提取物。7、虎眼万年青干细胞系形成层与抗癌组合物的制备方法制备1：功能性口服液剂型：将所述的干细胞乙醇提取物1g，含量为45％的樟芝多糖6g，含量为45％的姬松茸多糖6g，蜂胶60g，L-抗坏血酸0.3g，苯甲酸钠0.05g，无菌磁化水27ml，混溶后，放进一玻璃容器内，经40HZ超声波清洗机内，超声振荡20分钟，然后将其按常规法制成口服液剂型。制备2：功能性饮料剂型将所述的干细胞乙醇提取物溶解于60ml无菌磁化水中之后，加L-抗坏血酸0.2g，柠檬酸1g，甘露糖醇6g，苯甲酸钠0.05g之后，再加无菌磁化水适量，将其制成100ml的功能性饮料。