[发明专利]蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法

摘要

本发明涉及蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法，该方法包括以下的步骤：1）毛囊干细胞裂解备用；2）聚丙烯酰胺凝胶电泳包括a）制备8%分离胶；b）制备5%积层胶；c）30%聚丙烯酰胺0.33ml，10%SDS20μl，10%过硫酸胺20μl，TEMED2μl，加入后混匀，快速制胶；1.4ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速插入梳子，聚合完全后小心取出梳子；d）电泳；e）电转移；f）检测硝酸纤维上的蛋白质；g）免疫学检测。本发明由于采用了上述的技术方案，实现了转染后毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的检测。

主权项

蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）毛囊干细胞裂解a）用预冷的PBS洗毛囊干细胞3遍；b）加预冷的lysing buffer，6孔板：80μl/well；60mm培养皿：300μl/disk，4℃孵育20min；c）用细胞刮棒把细胞碎片连同lysing buffer集中于一侧，4℃孵育40min并转移至预冷的Eppendorf管中；12000g，4℃离心5min；d）将上清移入另一Eppendorf管中，除部分用来测蛋白浓度外，其余直接用于实验或‑70℃冷冻备用；2）聚丙烯酰胺凝胶电泳a）制备8%分离胶:1.5mM Tris‑HCl(pH8.8)1.3ml，dddH2O2.3ml，30%聚丙烯酰胺1.3ml，10%SDS50μl，10%过硫酸胺50μl，TEMED3μl，加入后混匀，快速制胶；3ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，随即以少量三蒸水封胶面，室温聚合30min，吸去上层三蒸水；b）制备5%积层胶:1mM Tris‑HCl(pH6.8)0.25ml，ddH2O1.4ml；c）30%聚丙烯酰胺0.33ml，10%SDS20μl，10%过硫酸胺20μl，TEMED2μl，加入后混匀，快速制胶；1.4ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速插入梳子，聚合完全后小心取出梳子；d）电泳:取含同等蛋白量的样本稀释至等体积，和5×sample buffer按4：1体积混匀，100℃水浴5min，乘热加样，每孔道30μl，加样后凝胶放置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电泳；电泳条件：积层胶内95V×15min，分离胶内165V×50min，待样品中的溴酚蓝迁移至胶的前沿时，结束电泳；e）电转移:SDS‑PAGE后，将聚丙烯酰胺胶卸下，取与凝胶相同大小的6张滤纸和一张硝酸纤维膜，在半干转移缓冲液中平衡15min，依次从下到上放好3张滤纸、凝胶、NC膜、另3张滤纸，然后夹于半干转膜装置中，膜朝正极，胶向负极，根据膜面积大小，以1.25mA/cm2的恒流，转膜90min；f）检测硝酸纤维上的蛋白质:将膜浸在丽春红染色液中染色，约3min可见红色蛋白质色带出现,然后将膜浸在蒸馏水中脱色，轻轻摇动数分钟，然后更换脱色液数次，直至背景色很淡；g）免疫学检测：1、封闭：转膜后，将硝纤膜置TTBS中，缓摇10min，然后膜于封闭液中37℃摇床缓慢平摇2h；2、结合一抗：封闭后将硝纤膜移入一抗（1：1000），4℃过夜或室温平摇3h；回收一抗，硝酸纤维浸入TTBS20ml中，急摇10min，连续3次，清洗膜上残 余一抗；3、结合二抗：将硝纤膜移入马抗兔二抗反应液（1：2000）中，室温平摇2h后，硝酸纤维膜浸入TTBS30ml中，急摇15min，连续3次，清洗膜上残余二抗；4、免疫复合物的检测：GE ImageQuant LAS4000化学发光成像分析仪显影拍照。