[发明专利]一种用VEGF165基因修饰的毛囊干细胞作为种子细胞的人工皮肤的制备方法

摘要

本发明涉及一种用VEGF165基因修饰的毛囊干细胞作为种子细胞的人工皮肤的制备方法。该方法包括以下的步骤：1）收集形态完好且处于生长期的毛囊；2)毛囊干细胞的纯化；3）毛囊干细胞的鉴定；4）包装慢病毒；5）慢病毒感染毛囊干细胞；6）明胶海绵三维组织支架制备；7）取之前4℃保存的明胶海绵支架，用注射法将细胞接种于明胶海绵支架内部和表面,该人工皮肤采用上述的方法获得。本发明以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。

主权项

一种用VEGF165基因修饰的毛囊干细胞作为种子细胞的人工皮肤制备的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L‑谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；2)毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次；3）毛囊干细胞的鉴定：a、采用Q‑PCR法：分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q‑PCR检测，用△△Ct法进行各基因表达的相对定量；b、细胞免疫荧光染色法：将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定后，再用5%BSA室温封闭；分别加入一抗整合素β1抗鼠多克隆抗体、整合素a6多克隆抗体以及角蛋白15多克隆抗体，室温孵育，PBST洗涤后，再加标记二抗避光30min，加DAPI染核5min，避光晾干，用mounting solution封片，观察；4）包装慢病毒：取对数生长期的293T细胞，提前24h接种于100mm培养皿中，待次日细胞长至50%‑70%即可；病毒包装采用钙转法进行：转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10％FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLenti‑IRES‑VEGF165‑EGFP10ug和3种包装质粒VSVG、RSV‑REV、RRE各5ug加入50ulHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH2O至500μl作为B液，另准备500μlCaCl2A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放置2min；逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10‑12h，更换为培养液为含10％FBS+DMEM高糖+1%双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45μm孔径滤膜过滤后，用超速离心机4℃，55000rpm/min离心3h，除去上清后，然后加100μl培养基吹打 分装成2管，‑80℃保存病毒液；5）慢病毒感染毛囊干细胞：取培养的毛囊干细胞，提前1天按照1×105/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50μl病毒原液和50μl补充培养基混匀的吹打后接种在预舖胶的24孔板，在37℃、5%CO2培养箱静置30min，再补加400μl补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰毛囊干细胞；6）明胶海绵三维组织支架制备：A.取含量为5%的明胶溶解于25℃的蒸馏水10ml，分别加入0.05%6‑硫酸软骨素钠盐和0.2%透明质酸钠盐；B.室温下用磁力搅拌器搅拌60分钟后，将交联剂0.5%1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液和0.25%N‑羟基琥珀酰亚胺溶液滴入溶液中混匀5分钟后，再将溶液注入12控办孔板的模具中，水平摇晃均匀；C.于‑80℃下冷冻2小时；D.然后上冻干机，冻干24小时得到厚度为2mm的多孔海绵状的Gel‑C6S‑HA支架；7）取之前4℃保存的明胶海绵支架，用75%乙醇消毒，再用PBS彻底冲洗；平铺于50mm培养皿中，置于37℃CO2培养箱中孵育1h；先将感染72h后的毛囊干细胞用0.25%Trypsin‑0.02%EDTA消化后，取细胞悬液，500r/min离心5min，弃上清，用1mlDMEM/F12液重新悬浮细胞并计数，用注射法以1×107/cm2的密度将细胞接种于明胶海绵支架内部和表面，DMEM/F12补充培养基培养，置于5%的CO2孵箱内37℃液面下培养2周，细胞融合后改为气‑液界面培养10d。