[发明专利]一种滇池金线鲃嗅囊细胞系的构建和超低温冷冻保存方法

摘要

本发明涉及一种利用滇池金线鲃嗅囊组织建立细胞系和超低温冷冻保存的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。该方法是以滇池金线鲃嗅囊组织为材料，采用组织块法，在含有胎牛血清，pH值为7.0-7.2的L-15培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行继代培养；具体包括制备细胞培养液、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、原代培养耗时短，细胞量大，能用于染色体分析；2、构建的滇池金线鲃嗅囊细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对滇池金线鲃种质资源保存和理论研究及应用的需要；3、该构建方法也适用于其它鱼类构建嗅囊的细胞系。

主权项

一种滇池金线鲃嗅囊细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其特征在于该构建方法的步骤如下：（1） 制备HBSS消毒液和细胞培养液HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使硫酸卡那霉素浓度为100µg/ml，庆大霉素浓度为20 µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；基础培养液：向L‑15培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%；原代培养液：向L‑15培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的20%，硫酸卡那霉素浓度为100µg/ml，庆大霉素浓度为20 µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；传代培养液：向L‑15培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的20%，硫酸卡那霉素浓度为50µg/ml，庆大霉素浓度为10 µg/ml，两性霉素B浓度为10 µg/ml；调节上述培养液的pH值为7.0‑7.2，放置于4℃冰箱中保存备用；（2） 原代培养先用8 mg/L高锰酸钾浸泡滇池金线鲃10 min，对鱼进行整体消毒后，再次以75%酒精消毒鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其嗅囊，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡嗅囊组织，浸泡15 min后，将嗅囊组织用HBSS消毒液清洗5次，剪成组织小块，并将其接种于25 cm2细胞培养瓶中，在20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液3 ml，在20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第4天细胞开始从组织块中迁移，20天长成细胞单层；（3） 传代培养原代嗅囊细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.13%的胰蛋白酶‑EDTA溶液1 ml，消化2min，细胞变圆后，加入传代培养液1 ml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于20℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第5代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；（4） 细胞冻存与复苏（a）配制细胞冻存保护液:冻存液包括胎牛血清和DMSO，按9:1的体积比混合，现用现配；（b）细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200 rpm离心8 min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为1×106个/ml，将1 ml细胞悬液转移至1.8 ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，‑80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；（c）细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15 ml离心管中，并加入等量基础培养液，1000 rpm离心8 min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20℃培养箱中培养，7天细胞即长成单层。