[发明专利]可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法

摘要

可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，包括：应用miRNA微阵列芯片技术获得miRNAs的差异表达谱，并用生物信息学方法和qRT-PCR技术进一步筛选验证，得到可调控ATXN3基因表达的miRNAs；用qRT-PCR技术及Westernblot技术确定miRNAs与ATXN3的靶向作用关系及作用机制；采用双荧光素酶报告基因检测技术确定miR-25与ATXN3基因的靶向作用关系及具体结合位点，为研发SCA3/MJD疾病相关诊断试剂盒提供依据。

主权项

可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）准备含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血各5~10ml，分离的血清分装后置于‑80℃备用；（2）TRIzol法提取步骤（1）血清中含miRNA的总RNAs；（3）应用miRNA微阵列芯片技术对步骤（2）中的总RNAs进行miRNAs表达谱检测，初步筛选得到SCA3/MJD分子标志物miRNAs；（4）对步骤（3）初步筛选得到的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，应用生物信息学方法和qRT—PCR技术在含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血中进行验证；(5）上调通过步骤（4）验证的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，利用Western blot技术检测转染所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs后内源性野生型及外源性突变型ataxin‑3蛋白表达水平：①HEK 293T细胞培养；②细胞转染：内源性ataxin‑3蛋白检测转染成分：negative mimics  100ng、 miR‑29a mimics 100ng、 miR‑34b mimics  100ng、miR‑125b mimics  100ng、 miR‑25 mimics  100ng、 siATXN3  100ng；其转染对象为HEK 293T细胞；外源性ataxin‑3蛋白检测转染成分：negative mimics 100ng 、 siATXN3  100ng 、miR‑25 mimics  100ng ；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；③内源性野生型及外源性突变型ataxin‑3蛋白表达水平检测：总蛋白提取，蛋白定量，SDS‑PAGE胶的制备，上样及电泳，转膜，封闭，加一抗，洗一抗，加二抗，洗二抗，曝光，显影及定影；（6）上调及下调步骤（5）明确的SCA3/MJD分子标志物miRNAs表达后，采用qRT‑PCR法检测内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平；①HEK 293T细胞或SCA3/MJD模型细胞培养； ②细胞转染：内源性ATXN3基因表达测定： siATXN3 50ng、 miR‑25 mimics 50ng、negative mimics 50ng、miR‑25 inhibitor 100ng、negative inhibitor 100ng、空转染组；其转染对象为HEK 293T细胞；外源性ATXN3基因表达测定：negative mimics 50ng、siATXN3 50ng、miR‑25 mimics 50ng；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；③内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平检测：a)总RNAs抽提；b)总RNAs纯度鉴定；c)总RNAs完整性鉴定；d）逆转录合成cDNA；e）qRT‑PCR：以β‑actin作为内参照，cDNA序列引物： ATXN3‑1F: GGCTCACTTTGTGCTCAACATTG ；ATXN3‑2R: TCTCATCCTCTCCTCCTCATCCAG；β‑actin‑1F:TGAAGGTGACAGCAGTCGGTTG ；β‑actin‑2R: GGCTTTTAGGATGGCAAGGGAC；f) 通过比较目的基因ATXN3和内参基因β‑actin的Ct值，应用2 ‑△△ Ct法对所得数据进行处理，计算目的基因ATXN3相对内参基因β‑actin的mRNA相对表达量；（7）应用双荧光素酶报告基因检测技术明确SCA3/MJD分子标志物miRNAs调控ATXN3基因的作用靶点；①生物信息学软件预测调控ATXN3表达的miRNA； ②构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达载体；③构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达突变体；④双荧光素酶报告基因活性检测：a)HEK 293T细胞培养；b)细胞转染：pmirGLO/WT‑ATXN3‑3'UTR转染组： pmirGLO/WT‑ATXN3‑3'UTR  150ng+miR‑25 mimics  25ng、pmirGLO/WT‑ATXN3‑3'UTR  150ng+negative mimics  25ng、pmirGLO/WT‑ATXN3‑3'UTR  150ng；pmirGLO/M‑ATXN3‑3'UTR转染组：pmirGLO/M‑ATXN3‑3'UTR   150ng+miR‑25 mimics  25ng、pmirGLO/M‑ATXN3‑3'UTR  150ng+negative mimics  25ng、pmirGLO/M‑ATXN3‑3'UTR  150ng；c)双荧光素酶活性分析。