[发明专利]一种制备雌二醇的方法

摘要

本发明属于生物细胞工程领域，涉及制备雌二醇的方法，具体涉及使用诱导后哺乳动物细胞体外培养制备雌二醇的方法。本发明的方法中，采用由哺乳动物细胞通过体外的特殊诱导所产生的细胞群，在体外特定的条件下培养，能源源不断地分泌雌激素；所述体系中雌激素的分泌完全模拟体内的合成过程，生成雌二醇过程中的副产品少、方法简单、条件温和，对环境几乎不构成危害；与现有技术的制备手段相比具有不可取代的优势。本发明方法在体外经过特殊条件诱导后哺乳动物的体细胞具有产生雌二醇的能力，该方法为获得雌二醇提供了一条新的途径。

主权项

1.一种制备雌二醇的方法，其特征在于，其包括步骤：(1)人骨髓来源细胞HMBDCs，保藏号CCTCC C2012173采用骨髓冲洗、贴壁法进行原代培养制备，制备的细胞培养于含15％胎牛血清的DMEM培养基，培养条件为37℃，5％CO2，直至105个细胞/培养瓶；(2)培养基中加入MCA，使其终浓度为1ug/ml，并每星期更换含MCA的培养基2次；MCA处理1周后结束；细胞在37℃，5％CO2环境中，持续常规培养；(3)培养至3个月，培养物中出现生殖细胞样细胞；上述生殖细胞样细胞表达生殖细胞的标志物：Oct4、Nanos3、c‑Kit、DAZL、Vasa；(4)培养液中检测到雌二醇的持续表达，与未经诱导处理hBMDCs相比，MCA诱导后hBMDCs中雌二醇的浓度高达50倍；重新传代，随培养时间的延长，雌二醇浓度进行性增加，传代培养至10天左右达到高峰，高达4500pmol/L；(5)在体外培养的诱导后hBMDCs中，见卵泡样结构的形成，诱导后hBMDCs中的卵母细胞样细胞体积达到40‑50微米；(6)卵泡相关基因包括STAR、p450arom、p450c17，以及卵泡发育相关基因GDF9在培养物中表达；(7)优化培养条件，增加雌二醇产生的能力，并降低培养液中血清的浓度；(8)分离、纯化，制得雌二醇。