[发明专利]DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变

摘要

本发明公开了DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变，包括提取样本、引物设计、PCR反应及DHPLC检测等步骤，其中目的片段长度为339bp，DHPLC检测柱温为59.5℃。本发明不仅能检测出突变型和野生型个体，还能准确检测到低水平或高水平的异质性突变个体，并能精确定量其突变负荷，从而可以较好地解释临床表型多样化的原因，有助于进一步研究线粒体耳聋的分子遗传学机制，本发明的最低检测水平可达到5%，灵敏度较高。

主权项

DHPLC检测并定量线粒体DNA 1555A>G的异质性突变，其特征在于包括如下步骤：1）提取线粒体DNA样本；2）引物设计，根据DHPLC方法的原理及检测要求，应用在线引物设计工具进行引物设计；3）确定PCR反应体系及反应条件，采用优化好的引物及PCR体系对线粒体DNA 1555A>G进行PCR扩增，得到PCR反应的产物；4）用DHPLC方法对PCR反应的产物进行异质性突变的检测：将PCR反应的产物在PCR仪中95℃变性5min，然后以1℃/min的速度缓慢降温至25℃，以充分形成异源性DNA双链； 然后采用DHPLC分析仪分析，每次自动进样8μL，采用流动相A液（0.1mmol/L TEAA，0.025％乙腈）和B液（0.1mmol/L TEAA，25％乙腈）将前述样本从分离柱中洗脱，检测柱温为59.5℃，洗脱液流速为0.9mL/min，洗脱曲线由紫外检测器检测获得，紫外检测器在260nm波长处收集信号。