[发明专利]罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法。该检测方法是根据GenBank公布的罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）序列的保守区域设计了MrNVRT-LAMP-LDF反应系统所需引物与探针；采用本发明人配制的病毒RNA提取试剂提取MrNV病毒RNA，使用本发明建立的MrNVRT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系中加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果。同现在该病毒的常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用，有利于罗氏沼虾白体病的诊断与预防。

主权项

一种罗氏沼虾野田村病毒RT‑LAMP‑LFD检测方法，其特征在于：包括如下步骤：病毒RNA的提取：（1）取20‑30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350‑500μL裂解液匀浆，离心；（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；RT‑ LAMP扩增反应：（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16‑21μL，包括：1.4‑2.0mmol/L 引物MrNV‑FIP，1.4‑2.0mmol/L引物MrNV‑BIP，0.2mmol/L 引物MrNV‑F3，0.2mmol/L引物MrNV‑B3，0.05‑0.15μmol/L 探针MrNV‑FITC‑PROBE，10‑30mmol/L pH8.0‑9.0的Tris‑HCl，10‑20mmol/L 氯化钾，10‑20 mmol/L 硫酸铵，5‑10mmol/L 硫酸镁，0.1‑0.3% Triton X‑100，0.4‑0.8mol/L 甜菜碱，1.4‑1.6mmol/L dNTP，1‑2U逆转录酶AMV，6‑10U Bst DNA 聚合酶大片段；引物MrNV‑FIP序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV‑BIP序列见SEQ ID NO：2，引物MrNV‑F3序列见SEQ ID NO：3，引物MrNV‑B3序列见SEQ ID NO：4，探针MrNV‑FITC‑PROBE序列见SEQ ID NO：5；（6）在16‑21μL预反应液中加入4‑9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20‑25μL，然后在60℃‑65℃下反应15‑60min；LFD试纸检测：（7）取步骤（6）所得RT‑ LAMP扩增反应产物5‑10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50‑100μL缓冲液，5‑15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。