[发明专利]一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法

摘要

本发明公开了一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法，首先在改良查氏培养基中培养产β-胡萝卜素降解酶的葡萄球菌，培养24h，10000r min-1离心20min取上清得到粗酶液，然后采用冷冻干燥将粗酶液浓缩，用于纯化。该方法采用蛋白纯化系统（AKTA purifier100system）和高效制备液相（PHPLC）相结合的方式纯化β-胡萝卜素降解酶，并通过HPLC检测酶纯度，能快速的纯化得到纯度达95%的纯酶。该发明前处理较为简单易行，纯化过程稳定，重复性高，可得到大量纯酶，为其在工业上用于降解β-胡萝卜素产香奠定基础。

主权项

一种β‑胡萝卜素降解酶的纯化方法，其特征在于，该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β‑胡萝卜素降解酶进行纯化，利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力，具体按下列步骤操作：1）在改良查氏培养基中培养葡萄球菌，培养条件为：37℃，恒温培养24h；2）培养结束后，将发酵液于10000r min‑1冷冻离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22μm有机系滤膜，得上样：3）纯化：纯化分三步：第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件：强阴离子柱MONO Q10/100GL，选择合适的缓冲液进行线性洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β‑胡萝卜素能力的活性成分；第二步，将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离，纯化条件：半制备色谱柱C18，选择合适柱温，以及合适流动相进行梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解β‑胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩；第三步，上样于蛋白纯化系统，条件：多肽分子筛Superdex peptide10/300column，选择合适的缓冲液洗脱，选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测；采用分析液相检测纯度的条件：色谱柱C18，选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测；将底物β‑胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立β‑胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线，用以计算β‑胡萝卜素降解酶的酶活和比活力。