[发明专利]一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法

摘要

本发明涉及一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，根据本发明的培养方法，包括以下步骤1）通过三次扩增获得发酵工作种子液；2）发酵前准备向发酵罐中添加泡敌、发酵培养基，将发酵工作种子液接种于发酵罐；3）发酵控制发酵条件，当生长至OD600=20时，开始补料流加培养直至发酵结束；4）当OD600=30时，添加IPTG诱导表达，结束后离心，即得目的菌体。本发明采用的培养方法和培养基具有高稳定表达的特性，通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平较高，且工艺简便，稳定性好，易于工业化大生产。

主权项

一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到10ml LBA培养基，在35～37℃，110‑140rpm，培养至OD600＝0.8‑1.0，得到一级种子培养液；第二次扩增：将一级种子液按5％‑10％的接种量接种至100ml LB培养基，在35～37℃，110‑140rpm，培养至OD600＝0.8‑1.0，即得二级种子液；第三次扩增：将二级种子液以3％‑7％的接种量接入1.5L LB培养基，在35～37℃，110‑140rpm，培养至OD600＝0.8‑1.2，即得发酵工作种子液；(2)发酵前准备：罐体及管道灭菌，配制培养液，在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液，121℃灭菌20分钟，冷却至30℃时，再加入之前单独灭菌的15％酵母提取物500ml，600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；(3)发酵：控制发酵条件，发酵温度30‑37℃，用氨水调节pH值为6.6‑6.9，初始溶氧量25‑30％，调节转速为150‑250rpm，每隔两小时转速提升20‑30rpm，当OD600＝20‑22时，开始用蠕动泵加入补料培养基，进行补料，补料的流加速度为6‑7ml/min；(4)诱导：当OD600＝30‑32时，开始添加IPTG 10‑12ml进行诱导，诱导表达结束后，收集菌液，离心，分离，即得目的菌体；(5)上述培养基组成为：LBA培养基：每升H2O中蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；发酵培养基：A液：每升H2O中含KH2PO4 25‑40g、K2HPO4·2H2O 57.5‑80g、(NH4)2SO4 17.5‑25.8g、FeSO4·7H2O 0.008‑0.015g；B液：每升H2O中含CaCl2·2H2O 0.8‑1.6g、CoCl2·6H2O 1.60‑2.93g、CuSO4·5H2O 1.5‑2.5g、FeSO4·7H2O 1.80‑2.87g、MnSO4·H2O 1.0‑1.93g、Na2MoO4·2H2O 1.60‑2.67g；C液：每升H2O中含20％酪蛋白25.0‑41.67ml、1M MgSO4 16.67‑36.67ml、50mg/ml卡那霉素10.0‑23.33ml、70％葡萄糖600‑1000ml、40％(NH4)2SO4 80‑120ml、5％柠檬酸1.67‑5.0ml；补料培养基：D液：每升H2O中含20％酪蛋白1.67‑2.22ml、1M MgSO4 10.42‑17.36ml、50mg/ml卡那霉素0.56‑1.11ml、A液55.56‑83.33ml、70％葡萄糖208.33‑347.22ml、40％(NH4)2SO4 20‑30ml、水518.76‑703.46ml。