[发明专利]利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法

摘要

本发明公开了利用花粉介导反义表达S‐RNase创制梨自交亲和新种质的方法，属于分子遗传学领域。利用双酶切方法构建反义表达载体pGSA1285‐S3，以‘黄花梨’花粉为载体，通过超声波处理花粉介导法将反义表达载体pGSA1285‐S3转入‘丰水’梨，对后代株系的分子鉴定共筛选出含反义表达载体的植株3株，获得自交亲和性梨新种质，弥补了目前自交亲和性梨品种资源稀少的现状，为培育和创新梨自交亲和性品种提供了新的途径，同时也为S‐RNase基因蛋白产物功能验证提供了很好的试材，具有良好的育种实践意义和理论研究价值。

主权项

利用花粉介导反义表达S‐RNase创制梨自交亲和新种质的方法，其特征在于包含以下步骤：（1）构建反义表达载体pGSA1285‐S3：①根据S3‑RNase基因的mRNA序列，设计正反向引物S3PF：SEQ ID NO.1、S3PR：SEQ ID NO.2，以‘丰水’梨花柱cDNA为模版，PCR扩增获取S3‐RNase基因cDNA序列全长；②将S3‐RNase基因全长转化PMD19载体，以转化质粒为模板，用带有酶切位点的特异引物S3‐PF2：SEQ ID NO.3和S3‐PR2：SEQ ID NO.4PCR扩增长度为449bp的S3‐RNase基因反义表达片段，将带有酶切位点的反义表达片段转化PMD19载体，获得含S3‐RNase基因反义表达片段的PMD19重组质粒PMD‐S3；③对重组质粒PMD‐S3以及真核表达载体pGSA1285进行Nco I/BamH I双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收S3‐RNase基因反义表达片段和pGSA1285线性载体并连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑取氯霉素抗性单克隆，检测确定为成功构建的反义表达载体pGSA1285‐S3；（2）获得转基因苗：利用花粉介导转化pGSA1285‐S3载体至‘丰水’花柱，完成授粉受精，并获得后代种子，通过冬季层积处理，春季播种培育获得幼苗；（3）PCR检测转基因植株：提取上一步获得的幼苗叶片基因组DNA，以上游引物35S‐F：SEQ ID NO.5和下游引物S3‐PR2：SEQ ID NO.4，对样品DNA进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，存在约1000bp的反义表达载体目的片段，确定为自交亲和的转基因植株。