[发明专利]可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法

摘要

本发明涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBVB型和非B型的双探针实时定量PCR法。本发明建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。该方法包括以下步骤：（1）设计保守引物，及针对B型和非B型的Taqman探针；（2）提取血清样本中HBVDNA；（3）双探针实时荧光定量PCR,同时对HBVDNA进行分型和定量。本发明建立的双探针实时定量PCR法准确、灵敏、特异、重复性好，可以同时进行HBVDNA的定量检测和基因分型，适合于临床推广。

主权项

一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于：包括以下步骤：（1）通过对已明确基因型的HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计保守引物，即上游引物F和下游引物R，同时选择型特异性碱基聚集区设计针对B型和非B型的Taqman探针，其中B型探针5′端标记Hex荧光基团，非B型探针5′端标记FAM荧光基团，两者3′端均标记猝灭基团；（2）提取血清样本中HBV DNA；（3）双探针实时荧光定量PCR：保守引物能扩增所有基因型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBV DNA，然后在PCR反应进行时，Taqman探针被Taq酶水解而发出荧光，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值,同时对HBV DNA进行分型和定量。