[发明专利]同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒及其制备方法和使用方法

摘要

同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒及其制备方法和使用方法，属于人畜共患传染病病原体的基因检测领域，该PCR试剂盒由PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；PCR反应液包括鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液。该PCR试剂盒实用性强，可直接检测样品中污染的布鲁氏菌的种型，检测速度快，灵敏度高，灵敏度达到102cfu/mL，特异性强，可重复性好，安全可靠、快速简便，可对样品中的布鲁氏菌的种型进行定性检测，可替代传统的病原学和血清学方法。

主权项

同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒，其特征在于，该PCR试剂盒由PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；所述PCR反应液包括鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物，分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：正向引物PIS711f：5′‑TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT‑3′，反向引物P494r：5′‑GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC‑3′，反向引物P732r：5′‑AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA‑3′，正向引物P591f：5′‑CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG‑3′，反向引物P591r：5′‑TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG‑3′，正向引物P272f：5′‑GGAACACTACGCCACCTTGT‑3′，反向引物P272r：5′‑GATGGAGCAAACGCTGAAG‑3′；所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌阳性质控标准品、羊种布鲁氏菌阳性质控标准品、猪种布鲁氏菌阳性质控标准品和犬种布鲁氏菌阳性质控标准品；所述牛种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒组成，所述羊种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒组成，所述猪种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒组成，所述犬种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒组成；所述含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒、含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒、含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒和含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD‑18T重组质粒均能在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；所述含有494个碱基的核苷酸片段的序列为：5′‑gacgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatga aacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatc acggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttcta gggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgc atcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcg attgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtg atcggca‑3′，所述含有732个碱基的核苷酸片段的序列为：5′‑tgccgatcacttaagggccttcattgccagcaatctcaaggcaacggctcagatcaaggtcaatccaacacgtt ccagtgtcccaacaatcgactggaggctgtacaaggaacgccatcagattgaatgcttttttaacaagttgaaacgctatcgt cgtattgcgctgcgatgcgagaaaacattgaccgcattcatgggcttcgtccatctcgcatgcgctatgatctggttacgttg aatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccata cttgcaacagtgacagcgataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctattccaatctcgcta ttgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtggattattctgagccgaaacactcctgattttttaggggtgccgc ttgttaaggcgattcacgacaagaaacttcttatagtcgatggtgcaccatggctaagtttgggtgtcatgaccgcgatttacg tcaaagacggtgaatatgagcggcttgtgtgcaccggagaggtagtaaacgttcagacaaataagctggttcagattcatat ccggggttatgaagaaatttataacgatatcgaagctgttggtgaaaaacttaatcagaccagcaaggacgcgattt‑3′，所述含有591个碱基的核苷酸片段的序列为：5′‑ctggtgggtatcgcattactcggcgccctggggctgacggggctgacaagtagcggcatcggggcggtggc tgccggcgggcttctcggttttgccctgttcaaccgcccgcctgccagcatttttctcggcgattccggaagccccccattg gggctgatcgtaggaacagccttgctgctgcttgcgcgtgaaacacacatcgtggtcgcgcttgttctgccgctttattatatt ctggatgcgggcaccacaattgtcatgcgtgcagcccaaggtgagaacatcctcaaggctcactcgaaacatgcctatca gatagcaaaacgcagtggctggagtgtgccgaaagtggtggcccatgtggcgcttttaaatacaatcctgatcgcctgcgt ggtggccttgctggcgctggatcatccgctcgcacaactgacatttctgctggtcgcagccgttgccacactcattctgctg ctcgatttccgcgggcgcttcaggaagctatgacctcgaaaagcaccttgcggaccatttcgatatccttcttttccatggcg gtccgcagtaccgccaggctttcctgaa‑3′，所述含有272个碱基的核苷酸片段的序列为：5′‑gatggagcaaacgctgaagcccaagcgaggccccgaaatagaccaggaagagcgtcaggagttccggca gaccgcgaaagatggtggtgtagatattagccgcaagccgcatcgaaggttcgctggactgcttgcccagagcgaccag aaaaccgaggatgagaccaacgggaagtgtggcgagtgccagactgacggtaacaagaagtcctttggcaatgctgata ccccagccatcgggaccgaaactcaacaaggtggcgtagtgttcc‑3′。