[发明专利]唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法。所述唾液腺组织特异性的转基因载体是通过将小鼠腮腺蛋白启动子上游调控区序列和可视化筛选neo-EGFP融合双标记整合到piggyBac转座系统和Lox-Cre酶系统中构建得到，该转基因载体可使目的蛋白在特定组织表达，实现大片段的高效整合效率；且该载体还具有便于筛选的绿色荧光标记和真核细胞筛选的新霉素抗性基因，使转基因细胞筛选和转基因动物鉴定更简单、直接、准确；本发明的转基因载体是一种唾液腺特异表达高效整合通用载体，可用于转基因小鼠和猪等动物方面转基因应用。本发明首次克隆FVB小鼠上游调控区，克隆方法简单高效，有效克服了大片段载体构建难度。

主权项

一种唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175‑CAGGS‑EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5‑3μL混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo‑EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo‑EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA‑Neo‑T2A‑EGFP载体；(2)、以质粒pPB‑UbC‑EGFP‑neo为模板，分别以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12作为引物，进行PCR扩增得到NotⅠ‑5‑PB‑NotⅠ，XhoⅠ‑3‑PB‑XhoⅠ，分别采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，连接在载体pPSPBGPneo‑XynB上，得到载体pPSPBGPneo‑PB‑XynB；(3)、以步骤(1)得到的pcDNA‑neo‑T2A‑EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14作为引物进行PCR扩增得到infusion‑CMV‑neo‑T2A‑EGFP片段，切胶纯化；用ClaⅠ和BglⅡ双酶切步骤(2)得到的载体pPSPBGPneo‑PB‑XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion‑CMV‑neo‑T2A‑EGFP片段重组到pPSPBGPNeo‑PB‑XynB载体的两个loxp位点中间，得到pPSPBGPneo‑T2A‑EGFP‑PB‑XynB载体；(4)、以步骤(3)得到的pPSPBGPneo‑T2A‑EGFP‑PB‑XynB载体为模板，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB‑lox‑neoEGFP‑loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架；(5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4009bp片段，将4009bp片段与新载体骨架pPB‑lox‑neoEGFP‑loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体1；(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(5)的中间载体1的StuI位点，即为中间载体2；(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤(6)的中间载体2上，得到载体pPB‑MusPSP‑neo‑EGFP，即为唾液腺组织特异性的转基因载体。