[发明专利]一种45S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法

摘要

本发明公开了一种45S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法，它主要包括染色体标本制备、45S rDNA探针制备、染色体荧光原位杂交、杂交信号检测等步骤，重点解决了现有荧光原位杂交探针的标记复杂繁琐的方法，提供一种简便、快速、准确的探针标记和杂交方法。本发明的探针为寡核苷酸探针在合成时可加入荧光基团修饰，不用再进行标记，与现有技术相比方法简单、成本低廉。利用这种技术能够在三小时内完成45S rDNA在染色体上的FISH定位。

主权项

一种45S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法，其特征在于按如下的步骤进行：染色体标本制备（1）按常规植物材料培养，待种子或植株根尖长至0.5‑1cm；（2）切下生长旺盛的根尖，用饱和对二氯苯溶液室温下预处理3‑5小时；（3）吸去预处理液，根尖用蒸馏水或0.075mol/L 氯化钾低渗30min，然后用3:1（甲醇:冰醋酸）固定液固定20min‑1小时；（4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液；（5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时； （6）蒸馏水洗去酶液，用0.075mol/L 氯化钾后低渗15‑30min，用3:1甲醇：冰醋酸固定液固定20min；（7）取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥；（8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色10min，自来水冲洗凉干；（9）镜检，选择分散良好的染色体标本放在‑20℃冰箱中保存待用；45S rDNA探针制备从拟南芥45S rDNA序列中选取一段20个碱基左右的高度保守序列，合成时在探针的5’或3’端连接一个荧光基团：5’‑TCGTAACAAGGTTTCCGTAG ‑3’，5’端带绿色荧光标记FAM；染色体荧光原位杂交：A：染色体标本预处理 （1）在荧光显微镜上记下已标记分裂相的坐标，并用玻璃刀在载玻片背面标记分裂相的位置；（2）将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥；B：染色体标本变性（1） 在标记处加30μL 70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中70℃处理2min；（2）去掉盖片，‑20℃的70%、85%、100%冷乙醇系列脱水，每级3min，空气干燥；C：杂交 （1）用2×SSC稀释探针至5ng/μL；（2）每张标本加10μL探针，并盖18×18mm的盖玻片；（3）于湿盒中37℃杂交1‑2小时；D：杂交后洗脱 （1）在4×SSC，0.2%Tween 20中室温下避光洗涤10min；（2）蒸馏水冲洗片刻，避光空气干燥；E：杂交信号检测 （1）滴加3μL含有DAPI的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片；（2）Nikon 80i荧光显微镜观察，按照所记录的标本坐标在紫外光激发下可观察到蓝色的分裂相，在蓝色激发光激发下可观察到绿色的45S rDNA杂交信号；（3）SPOT RT KE冷CCD进行图像采集，SPOT 4.1软件进行图像合成。