[发明专利]由种公牛体外受精率对种公牛精子体内受胎率的评价方法

摘要

一种由种公牛体外受精率对种公牛受胎率的评价方法，属于动物繁殖技术领域，将COCs分别用牛卵母细胞捡卵液、牛卵母细胞成熟液洗后，放入牛卵母细胞成熟液中培养后，放入用BO-AB液获能的牛精子滴中受精；再用IVC SOF液脱掉颗粒细胞，把脱掉颗粒细胞的卵子放入SOF液中培养，测出体外受精卵裂率；同时进行人工授精，测出种公牛的受胎率，通过卵裂率与受胎率的关联性对种公牛进行评价。本发明的优点是利用种公牛精子体外受精率，较快的估测出种公牛的实际受胎能力，及时了解种公牛繁育能力，省去了人工授精检测个体种公牛繁育能力需要耗费大量时间、人力和财力的问题，节约了资源。

主权项

1.一种由种公牛体外受精率对种公牛受胎率的评价方法，其特征在于：它包括如下步骤：一、配制试剂：按照牛卵母细胞捡卵液、牛卵母细胞成熟液、牛体外受精液BO-A、BO-B、BO-AB、牛体外受精培养液Stock A、Stock B、Stock C、Stock D、StockX、Stock Y、Stock Z、IVC SOF液的次序排列；（1）配制牛卵母细胞捡卵液：H-M199（GIBCO，12340）+10%FBS4℃保存，使用期限为一个月;（2）配置牛卵母细胞成熟液:M199(GIBICO,11150)+1μg/mlE2+0.1IU/mlFSH+1IU/mlLH+10%FBS4℃保存，使用期限为一个月;（3）配制牛体外受精液BO：4℃保存，使用期限为一个月;（4）配制牛体外受精液BO-A：现配现用;（5）配制牛体外受精液BO-B：现配现用;（6）配制牛体外受精液BO-AB：等量BO-A与BO-B混合；现配现用;（7）配制牛体外受精培养液Stock A：4℃保存，使用期限为一个月;（8）配制牛体外受精培养液Stock B：4℃保存，使用期限为一个月;（9）配制牛体外受精培养液Stock C：4℃保存，使用期限为一个月;（10）配制牛体外受精培养液Stock D：4℃保存，使用期限为一个月;（11）配制牛体外受精培养液Stock X：4℃保存，使用期限为一个月;（12）配制牛体外受精培养液Stock Y：4℃保存，使用期限为一个月;（13）配制牛体外受精培养液Stock Z：4℃保存，使用期限为一个月;（14）配制牛体外受精培养液IVC SOF液：SOF液体总体积10mlstockA1mlstockB1mlstockC100μlstockD100μlstockX100μlstockY100μlstockZ100μlNEAA100μlEAA200μlBSA0.08gP/S10μl酚红10μl超纯水7.18ml4℃保存，使用期限为一个月;二、体外受精：（1）牛卵细胞的成熟培养：①屠宰3h之内的新鲜牛卵巢用无菌生理盐水冲洗3次并浸泡在干净的生理盐水中,用20ml注射器17^#针头抽取直径在2-8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘-卵母细胞复合体COCs；②把牛卵母细胞捡卵液与牛卵母细胞成熟液分别放在38.5℃，5%的二氧化碳培养箱中平衡1h以上，然后将拣出的COCs用平衡好的牛卵母细胞捡卵液洗一遍，牛卵母细胞成熟液洗两遍后，取一四孔板，每孔先加入500μl牛卵母细胞成熟液，再加入500μl石蜡油，按照每孔50-120枚的数目放入牛卵母细胞成熟液中，在38.5℃，5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养22h；（2）体外受精：①取50ml烧杯两个，分别标记为A和B：A配制牛体外受精液BO-A，B配制牛体外受精液BO-B；将配置好的牛体外受精液BO-A使用0.2μm过滤器过滤到新的50ml烧杯中，配好的牛体外受精液BO-B使用0.2μm过滤器过滤到新的50ml烧杯中，均放入37.5℃恒温水浴锅中预热；②取牛原精1000万，加入预热的牛体外受精液BO-A5ml，将精子轻轻混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml预热的牛体外受精液BO-A轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，用预热的牛体外受精液BO-AB将牛精子浓度稀释为1000万/ml；③将②处理好的精液在35mm皿中做100μl的精子滴，做好后加入石蜡油放入培养箱中；④打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出步骤2（1）②成熟22h的牛卵细胞，在预热的牛体外受精液BO-AB中洗3次，将③中做好的精子滴从培养箱中拿出，每个精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%CO₂培养箱中培养6h；（3）受精卵的体外发育培养：经步骤2（2）④受精6h后，用培养箱中预热的IVCSOF液脱掉颗粒细胞，然后，把脱掉颗粒细胞的卵子放入预热的每孔含500μlIVCSOF液上盖500μl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱继续培养；　（4）体外卵裂率检测：受精48小时统计卵裂率；卵裂率=正常卵裂的胚胎/用于受精的卵子数；三、人工输精：（1）母牛的选择：A、青年牛16-18月龄、体重275-350Kg；B、经产牛产后60-90天、子宫复旧良好；发情规律、产后第二次自然发情时输精;（2）精液的选择：按照国家标准，选取解冻后精子活力大于30%，畸形率小于20%，每毫升精液中细菌菌落数小于1000个，顶体完整率大于40%，37℃存活时间大于4小时的种公牛细管冷冻精液；（3）母牛发情鉴定：A、外部观察法：主要是根据母牛的外部和精神状态来判断发情的状况;B、阴道检查法：用阴道开张器观察阴道的黏膜、分泌物和子宫颈口的变化来判断母牛的发情状况;C、直肠检查法：主要是检查卵巢的卵泡发育情况;（4）冻精的解冻与人工输精：输精时间和母牛排卵时间为发情结束后6-12小时，越接近越好；（5）种公牛受胎率统计：输精60天后检测母牛是否怀孕受胎率=怀孕母牛头数/输精母牛总头数四、种公牛体外受精卵裂率与人工授精受胎率关联性比较评价标准评价标准分级体外受精卵裂率范围人工授精受胎率评价范围145%—60%40±5%260%—80%50±5%3＞80%60±5%