[发明专利]一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法

摘要

本发明提供的一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法,用于检测向日葵白锈病菌的Padlock探针PHPL序列：5′-GGACGCGATTCGCTTCCCTTTCAGCAGTP1P2GCGGCATACGTTCGTCAAATACGGAATGGACAGC-3′；分步骤1）Padlock探针连接体系；2)切除自连和错连的Padlock探针配制10µL的体系包括：50mMTris–HCl，5.0mMMgCl2，1mMDTT，2U核酸外切酶Ⅰ和2U核酸外切酶Ⅲ；然后与10µL的Padlock探针连接体系混合，37℃反应2h，95℃灭活3h；3)Padlock探针扩增程序;4)PCR产物电泳检测;5)芯片制备、扫描、检测其结果。

主权项

一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法,其特征在于：用于检测向日葵白锈病菌的Padlock探针PHPL序列：5′‑GGACGCGATTCGCTTCCCTTTCAGCAGT P1P2GCGGCATACGTTCGTCAAATACGGAAT GGACAGC‑3′；1Padlock探针连接体系及反应程序1.1Padlock探针连接体系10μL的体系包括：20mM Tris–HCl，25mM KCH3COO，10mM Mg(CH3COO)2，10m MDTT，1mM NAD，0.1%Triton X‑100，20ng鲑鱼精DNA，10U Taq DNA连接酶，100pM Padlock探针，20ng模板DNA；反应程序：95℃预变性，5min；95℃变性30S，65℃连接5min，共20个循环；95℃灭活，15min；1.2切除自连和错连的Padlock探针配制10μL的体系包括：50mM Tris–HCl，5.0mM MgCl2，1mM DTT，2U核酸外切酶Ⅰ和2U核酸外切酶Ⅲ；然后与10μL的Padlock探针连接体系混合，37℃反应2h，95℃灭活3h；1.3Padlock探针扩增程序采用引物P1/P2:TCATGCTGCTAACGGTCGAG/CCGAGATGTACCGCTATCGT对外切酶切除后的产物进行PCR扩增，PCR反应体积为25μL，各成分浓度分别为：1×PCR buffer，2.0μL dNTP nM，即10mM dATP、dGTP、dTTP各0.5μL，10mM dCTP0.25μL，0.25mM Cy3‑dCTP0.25μL，引物P1/P2各500nM，Mg2+2nM,1.25U Taq聚合酶，3μL酶切后的连接产物做模板；PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，40个循环；72℃延伸10min；1.4PCR产物电泳检测反应结束后取6μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶中100V电泳40min，在凝胶成像系统上拍照分析；1.5基因芯片检测1.5.1芯片制备利用基因芯片点样仪将cZipcode探针即终浓度为30μM点至醛基化基片上，每点重复4次，37℃湿盒中固定12h，固定后0.2%SDS洗液清洗10min，0.2%NaBH4即为1×PBS与25%乙醇混合液配制的0.2%NaBH4溶液，封闭液中封闭5min，再用去离子水清洗2min，重复3次，然后将芯片放入芯片甩干室中离心干燥30s，取出粘贴围栏加盖片；1.5.2芯片杂交与洗涤取6μL Cy3‑dCTP标记的PCR产物,95℃、变性5min，冰浴5min，变性产物与1μl3×10‑4mM杂交阳性对照、7μL杂交液即为2.5%甲酰胺、0.2%SDS、6×SSC混匀注入cZipcode探针区，封闭杂交盒，42℃杂交1h，杂交完毕取出芯片，用42℃洗液I，即为0.3×SSC，0.1%SDS，清洗4min，再用42℃洗液II，即为0.06×SSC，清洗2min,最后将芯片离心干燥30s，待扫描;1.5.3芯片扫描检测用Ecosamp ler TM芯片扫描仪扫描，进行图象分析，信号绝对值大于500，信噪比大于3.0，判为阳性；信号绝对值小于500，信噪比小于2.0，判为阴性；信号模糊，需重复验证。