[发明专利]基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用

摘要

本发明公开了一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用，属于电致化学发光领域；它先将壳聚糖滴涂于电极表面，通过共价作用先后将石墨烯量子点和多肽组装到电极表面；在蛋白激酶和三磷酸腺苷的作用下，多肽发生磷酸化，通过抗原-抗体之间的特异性识别作用，磷酸化抗体共轭的氧化石墨烯被组装到多肽的磷酸化丝氨酸位点上，拉近了氧化石墨烯和石墨烯量子点之间的距离，使得石墨烯量子点的电致化学发光被猝灭。蛋白激酶的浓度越大，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装于传感界面的氧化石墨烯就越多，对石墨烯量子点的电致化学发光猝灭效应越强，实现了对蛋白质激酶的高灵敏检测。

主权项

基于GO和GQDs之间ECL‑RET作用的传感器制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：（1）采用Hummers方法制备氧化石墨烯：将1.0 g石墨和1.0 g NaNO3加入到46 mL的质量百分浓度为98%的H2SO4中，冰浴下缓慢加入6.0 g KMnO4，于35 °C水浴中搅拌1 h，加入80 mL超纯水，继续搅拌30 min，再加入200 mL超纯水后，逐滴加入6 mL的质量百分浓度为30%的H2O2，室温下反应1 h；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，将产物分散到500 mL超纯水中，超声处理2 h，即制得均匀分散的氧化石墨烯；（2）利用水热法制备石墨烯量子点：将干燥的氧化石墨烯置于管式炉中，在N2保护的条件下，以5 °C/min的升温速率加热到200 °C并保持2 h，得到石墨烯片；将0.05 g石墨烯片加入到体积比为1:3的浓硫酸:浓硝酸的混合溶液中超声17 h，加入250 mL超纯水稀释；用0.22 µm微孔滤膜过滤，将收集的滤饼悬浮在40 mL超纯水中，用NaOH调节溶液pH为8后，转移入反应釜中于200 °C反应12 h，冷却到室温；用0.22 µm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为石墨烯量子点溶液；（3）羧基化石墨烯量子点的制备：将0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸钠加入到20 mL的石墨烯量子点溶液中，超声反应3 h，用盐酸调节溶液pH为中性，即得到羧基化的石墨烯量子点；（4）抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯复合物的制备：将200 µL、1 mg/mL的氧化石墨烯和200 µL、5 µg/mL的抗磷酸化丝氨酸抗体混合，室温条件下反应12 h；将产物在10000 rpm下离心30 min，用超纯水清洗3次，将产物重悬于10 mM、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，4 ºC下保存；（5）ECL传感器的制备：玻碳电极先在粒径为1.0，0.3，0.05 µm的α‑Al2O3糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1 min；将10 μL、质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干后，将电极浸入到含有5 mM的N‑乙基‑N’‑1‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的羧基化石墨烯量子点溶液中，室温下孵化5 h；用10 mM、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗后，将电极插入到含有5 mM的N‑乙基‑N’‑1‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、8 mM的N‑羟基琥珀酰亚胺和50 μM的多肽溶液中反应3 h；再将电极插入到含有蛋白激酶和三磷酸腺苷的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中反应2 h，使多肽发生磷酸化；将磷酸化多肽修饰电极在抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯复合物溶液中孵化1 h，即制得ECL传感器。