[发明专利]分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法

摘要

本发明是一种分离纯化缘管浒苔（Enteromorpha linza）铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）的方法。该纯化方法包含50mM磷酸缓冲液抽提液、50%-70%硫酸铵盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析四个步骤。应用该方法将缘管浒苔铁超氧化物歧化酶纯化了103.6倍，回收率为19.1%，最终酶的比活力达1750U/mg蛋白。本发明还公开了缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的部分性质。

主权项

一种分离纯化缘管浒苔铁超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）样品处理：将采集的缘管浒苔先经过海水清洗去除泥沙和其他杂质，再用自来水和去离子分别清洗三次，挤干水；然后剪碎放入匀浆机中，并按1克浒苔加入3毫升50mM磷酸缓冲液、pH 7.4、含1 mM EDTA的比例，向匀浆机中加入4℃的50mM磷酸缓冲液，混匀并充分破碎浒苔细胞后将匀浆液置于4℃温度下冷藏2 h，然后取出过滤，取滤液在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液；（2）硫酸铵盐析：向上述上清液中先加入硫酸铵至50%饱和度，在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，取上清液继续加入硫酸铵至70% 饱和度, 在4℃温度下静置1 h后，在12000 g离心力作用下离心20 min，将沉淀物用10 mM、 pH7.4的磷酸缓冲液溶解并透析得酶液；（3）离子交换层析：将上述酶液装入层析柱中，层析柱选用GE healthcare的Q‑sepharose FF阴离子交换层析填料，安装到Bio‑Rad双流相快速蛋白层析仪上，柱床先用10 mM 、pH7.4的磷酸缓冲液溶平衡，设置程序分别进样，样品的线性洗脱和层析柱再生，线性洗脱溶液的浓度为800 mM氯化钠，流速0.8 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液合并和超滤浓缩，进行凝胶过滤层析；（4）凝胶过滤层析：将上述洗脱液按程序进入GE healthcare的Superdex 200 10/30 GL层析柱，洗脱液为10 mM、 pH7.4，含150 mM 氯化钠的磷酸缓冲液，洗脱流速控制为0.3 mL/min，收集洗脱液进行超氧化物歧化酶和蛋白浓度的检测，将有超氧化物歧化酶的洗脱峰的洗脱液进行透析并冷冻干燥得到缘管浒苔铁超氧化物歧化酶。